弧菌广泛分布于近海及河口的海洋环境,已经证明有多种弧菌是鱼类的重要条件性致病菌。弧菌病是引起全球水产养殖业病害泛滥、造成巨大经济损失的鱼类细菌病。弧菌的致病机理与它携带几种重要毒力基因有关,这些毒力基因编码不同的毒力因子,分别行使不同的功能,共同协作形成一套复杂的致病机制。在20世纪90年代发展起来的基因芯片技术,是高通量、微型化和自动化的新型分子生物学技术,是基因功能研究的有力工具。将该技术应用于水产动物病害监测,进行快速有效的早期诊断对防治工作来说是很重要的。采用十字交叉划线法、点种法和平板扩散法从160株海洋细菌中筛选出1株对鳗弧菌和哈维氏弧菌的生长有一定抑制作用的海洋细菌2004103101。将病原菌接种到2004103101菌的除菌培养上清中,设定对照组,通过在不同培养时间测量培养液的OD600再次确认其培养上清中是否含有抑制病原菌生长的物质。结果显示,这株菌对两种病原菌均有一定的生长抑制作用。2004103101菌革兰氏染色阴性,弯曲短杆状,TCBS培养基上菌落呈半透明黄色湿润扁圆形,有较强的体外溶血性,生理生化实验结果表明该菌与鳗弧菌相似。进一步对其16S rRNA的序列进行PCR测序和构建系统发育树,结果显示2004103101菌与鳗弧菌自然聚类,亲缘关系最近。综合上述结果可将2004103101菌鉴定为鳗弧菌。将这种拮抗菌对大菱鲆进行腹腔注射感染实验,以注射鳗弧菌和海水鱼用生理盐水分别作为阳性和阴性对照,经过14天的观察和结果分析,结果发现这株菌的毒力相对于鳗弧菌而言是很低的。为进一步探讨其毒力损失原因,针对鳗弧菌的毒力表型相关基因vah, empA, virC, virA, flaA和angM以及16S rRNA设计了7对PCR引物,以鳗弧菌和2004103101菌的基因组DNA为模板进行PCR扩增,发现与鳗弧菌相比较,2004103101菌缺失与表面抗原合成有关的virC基因,并且angM基因扩增片断的数量和大小也与鳗弧菌有一定不同。angM基因是鳗弧菌质粒pJM1和pEIB1所共有的,编码非核糖体多肽合成酶。利用基因芯片高通量、平行性的特点,选择针对各弧菌的16S rRNA、hsp60和2至6个不等的毒力相关基因,设计了由29个探针组成的寡核苷酸芯片和28对基因特异性引物。利用国际生物技术信息中心网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行每个基因序列的BLAST搜索和相关文献的检索,检索到各基因的同源序列后,再将各基因与其同源序列用omiga软件进行比对,找出保守区和特异区,分别处理保存后导入AlleleID 3.0软件或Array Designer 4.0软件,设计扩增产物片段长度为200-500bp的引物和长度为45-55bp的探针。将设计好的探针再全部导入omiga软件进行比对,确定探针之间最多不超过四个连续碱基相同,而且位置刚好处于引物扩增区,然后交由基因公司合成。将合成后的探针按照设定的位置分布用手动点样仪点在尼龙膜上,经紫外交联后固定在膜上组成寡核苷酸膜芯片。用酚-氯仿抽提法提取细菌总DNA作为PCR的模板,然后用基因特异性引物加入地高辛标记的dUTP扩增并标记各菌株的待测目的片段,标记后的PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检查后测定标记产量,然后配制成20ng/ml的杂交液同时与膜芯片进行杂交,对杂交时间、PCR产物浓度设计梯度试验以优化反应条件,检测芯片的灵敏度。杂交结束后的反应信号用NBT-BCIP液显色后进行分析。试验结果显示其中12个毒力相关基因均能特异性显色,无其它交叉反应,可以作为菌株是否含有该毒力基因的检测方法,作为菌株是否致病的重要参考指标,而每种弧菌的16S rRNA和hsp60探针点(共10个)则都会与其它一至三种弧菌的16S rRNA、hsp60发生交叉反应(溶藻胶的hsp60除外),其反应信号不能作为菌种准确鉴定的依据,只能作为菌株是否是弧菌的鉴定依据。试验中溶藻胶弧菌的omp、副溶血弧菌的trh、费氏弧菌的ampC在PCR反应中能很好的扩增出单一的目的条带,但在杂交信号中没有出现显色反应。试验中费氏弧菌的omp和cnf,灿烂弧菌的aerv和vsm未能扩增出目的条带,因这些基因有菌株特异性,说明试验菌株不是具有该基因的菌株。芯片检测灵敏度可达到2.56ng目的基因,相当于12.8pg细菌DNA。结果证明本试验中的膜芯片在结合16S rRNA、hsp60和毒力基因共同组成的图谱中,能够准确鉴别出鳗弧菌、哈维氏弧菌、灿烂弧菌、副溶血弧菌、溶藻胶弧菌和费氏弧菌等六种弧菌,以及样品是否含有试验所涉及的毒力基因。