胰腺癌是恶性程度最高的消化道肿瘤之一,中位生存期仅有3-6个月,五年生存率不足15%,并且在过去四十年中几乎没有提高。胰腺癌早期诊断困难,易发生转移,同时具有高度抑制的免疫微环境和极强的肿瘤异质性,易对化疗药物产生耐药性并且对放疗非常不敏感,故临床治疗效果十分有限,预后极差。因此,开发一种新型、高效的胰腺癌治疗手段或策略,对改善胰腺癌患者的生活质量和延长生存时间具有重要的现实意义。溶瘤病毒疗法作为肿瘤生物治疗的重要分支之一,具有杀伤效率高、靶向性好、副作用小、多种杀伤肿瘤途径避免耐药性、可通过重塑肿瘤微环境提升基于免疫检验点抑制剂的抗肿瘤疗效和可作为给药载体与其他疗法联用等优势,对多种实体肿瘤有较好的临床治疗效果。然而,溶瘤病毒作为单一的治疗手段在胰腺癌治疗上疗效仍十分有限。胰腺癌的肿瘤异质性高,不同胰腺癌细胞系对溶瘤病毒的敏感程度有很大差异。对于溶瘤治疗不敏感的抵制型肿瘤,通常解决办法是通过与增效剂联用来增强溶瘤病毒的治疗效果。小分子化合物是一类能够和溶瘤病毒联用达到增强疗效目的的理想药物。本研究旨在筛选出能够增强溶瘤病毒抗胰腺癌肿瘤活性的小分子药物,从而提高溶瘤病毒治疗胰腺癌的疗效。本研究首先比较了两种测定肿瘤细胞活性的检测方法,它们分别是基于检测细胞中脱氢酶活性的CCK8（Cell Counting Kit-8,CCK8）法和基于检测细胞中酸性磷酸酶活性的APA（Acid phosphatase assay,APA）法。结果表明两种方法均能较好地实现对肿瘤细胞的活性检测,但APA法的重复性和稳定性更好。基于此,本研究建立了一套以APA法为基础的、快速、高通量测定药物相互作用的筛选平台。利用这个平台在包含1518种小分子化合物的抗癌药物库中进行溶瘤病毒OVH的增效剂筛选,最终筛选出多种能够有效增强溶瘤病毒OVH对Panc 10.05胰腺癌细胞杀伤活性的小分子化合物,包括JAK抑制剂、FAK抑制剂、BRD4抑制剂和CDK4抑制剂等,并进一步在多株胰腺癌细胞中验证联用增效的广谱性。其中,BRD4抑制剂增强溶瘤病毒对胰腺癌细胞杀伤活性最强及对多株胰腺癌细胞的联用增效广谱性最高,因此被选择用于后续的研究。BRD4是一种重要的转录调控和表观遗传调控因子,其表达水平失调或功能紊乱与多种肿瘤的发生发展有关,是极具潜力的肿瘤靶点。为进一步探究BRD4抑制剂作为OVH增效剂应用于胰腺癌治疗的广谱性和安全性,本研究在4株胰腺癌细胞系和一株正常的胰腺导管上皮细胞hTERT-HPNE上评估BRD4抑制剂与OVH的联合杀伤效果。实验结果表明BRD4抑制剂可以增强OVH对胰腺癌细胞的杀伤,但不会增强OVH对正常细胞的杀伤。通过检测病毒蛋白表达水平及病毒滴度测定等方法,本研究证实了 BRD4抑制剂可有效提高OVH的复制水平。类似地,使用重组表达PD-1单链抗体的溶瘤病毒OVH-aMPD-1与BRD4抑制剂联合处理胰腺癌细胞后,OVH-aMPD-1在胰腺癌细胞中的PD-1单链抗体表达量也显著增加了。为探索BRD4抑制剂与OVH协同杀伤胰腺癌细胞的分子机制,本研究从BRD4抑制剂对胰腺癌细胞的作用入手展开研究。一方面,BRD4抑制剂可能通过抑制肿瘤细胞先天性抗病毒免疫反应来促进OVH的存活,从而实现提高OVH对肿瘤细胞的杀伤。但实验结果发现抑制肿瘤细胞内BRD4信号通路并不会降低I型干扰素信号通路相关基因表达,说明BRD4对OVH的增效作用不依赖于先天性抗病毒免疫反应。另一方面,由于BRD4蛋白在胰腺癌细胞中高表达,通过抑制胰腺癌细胞中BRD4的活性或许有助于OVH的感染复制。为了验证这一猜想,本研究构建了敲低BRD4表达的AsPC-1细胞株,发现BRD4敲低后该细胞对OVH更敏感,也有助于OVH在其中的复制。最后,本研究在免疫缺陷鼠上建立了 AsPC-1皮下荷瘤小鼠模型,评估BRD4抑制剂与溶瘤病毒OVH联合治疗胰腺癌的效果。结果发现BRD4抑制剂与OVH联用具有协同抗肿瘤作用,可以有效抑制对任一单药治疗均无效的胰腺癌生长。动物实验结果还表明BRD4抑制剂和OVH联合治疗具有较好的安全性。综上,本研究建立了以APA法为基础的、快速、高通量测定药物相互作用的筛选平台,筛选出多种与OVH具有协同抗肿瘤作用的小分子抑制剂。进一步研究表明BRD4抑制剂增强溶瘤病毒对胰腺癌细胞杀伤活性最强及对多株胰腺癌细胞的联用增效广谱性最高。接着在体内和体外模型上分别验证了 BRD4抑制剂与OVH联合的治疗效果和安全性,并证实BRD4抑制剂可促进OVH的复制从而增强对胰腺癌细胞的杀伤。最后初步探索BRD4抑制剂与OVH协同杀伤胰腺癌细胞的分子机制,两者联用对胰腺癌细胞的协同杀伤不依赖先天性抗病毒免疫反应的Ⅰ型干扰素信号通路,而是通过直接促进病毒在胰腺癌细胞中复制以及提高胰腺癌细胞对OVH的敏感性实现的,具体机制仍有待后续进一步深入探索。