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重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis,SAP）是一类以胰腺广泛炎症反应伴组织坏死为主要特征,发病急、病情重、病死率高的腹部急症。在SAP早期,失控的全身炎症反应所造成的多器官损伤是患者死亡的主要病理生理基础。其中,胰腺炎相关肠道损伤（pancreatitis-associated intestinal injury,PAII）是SAP早期病程中最常见的胰外并发症,且与SAP的严重程度密切相关。据报道,肠道尤其是小肠不仅是SAP进程中的受累器官,更是全身炎症反应的助推器。因此,积极预防PAII的发生或减轻其损伤程度,在SAP治疗中起着重要作用。此前已有研究证实,在SAP早期,对患者实施腹腔穿刺引流（abdominal paracentensis drainage,APD）,排出含多种毒性物质的胰腺炎相关腹水（pancreatitis associated ascite fluid,PAAF）,对减轻全身炎症反应程度,降低肠道屏障功能损害具有明显正向作用,然而目前对其具体保护机制的认识尚有限,亟待研究。Toll样受体4（Toll-like receptor 4,TLR4）是哺乳动物体内最有代表性的模式识别受体家族成员之一,其作为细胞膜上的跨膜蛋白,可将细胞外抗原信息传递至胞内并引发炎症反应。近期研究表明,TLR4在SAP炎症反应的启动和器官损伤中均发挥着重要作用。通过依赖髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88,My D88）途径,TLR4可介导下游核因子-κB（nuclear factor-κB,NF-κB）的激活,从而诱导包括肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白细胞介素-6（interleukin-6,IL-6）等炎性细胞因子的表达和释放,进而造成炎症反应正反馈的恶性循环。据报道,TLR4/NF-κB促炎信号通路的活化与SAP引起的肠道炎症反应和黏膜细胞凋亡有密切关系,但该通路需要TLR4与其特定的配体相结合方可激活。高迁移率族蛋白1（high mobility group box protein 1,HMGB1）是损伤相关分子模式家族的重要成员之一,已被证实是TLR4最重要的内源性配体。在细胞外,HMGB1作为致死性炎症反应的晚期介质,参与了SAP进程中胰腺及远位脏器损伤的发生和发展。通过于腹腔内主动注射HMGB1的中和抗体可显著减轻SAP小鼠的肠屏障功能障碍。我们前期的研究表明,通过引出高浓度HMGB1的PAAF,APD可以有效降低循环HMGB1水平。因此,我们推测早期实施APD降低HMGB1水平可能在SAP相关肠损伤中发挥着保护作用。然而,目前对于此治疗策略如何发挥肠道保护作用及其具体作用机制还知之甚少,亟须进一步研究。基于此,本课题首先探讨早期实施APD对SAP大鼠肠道炎症反应及伴随的粘膜细胞凋亡的影响,继而明确肠道TLR4/NF-κB信号通路在APD治疗中的变化情况。最后,在建立轻型胰腺炎大鼠模型基础上,通过腹腔注入含或不含HMGB1中和抗体的PAAF,进一步明确APD是否通过减轻HMGB1所介导的肠道组织TLR4/NF-κB信号通路的激活而发挥对肠道的保护作用。方法及结果:第一部分实验中,我们将体重190-210g成年雄性SD大鼠随机分为假手术组（Sham组）、SAP组和APD组,每组15只,采用5%牛磺胆酸钠胰胆管逆行注射法建立SAP大鼠模型,在此基础上于大鼠右下腹置入引流管建立APD模型。第二部分实验中,我们通过腹腔内连续注射雨蛙素（20μg/kg,6次,1h间隔）的方法制备轻型胰腺炎大鼠模型（mild acute pancreatitis,MAP）,然后随机分为四组,每组6只大鼠:轻型胰腺炎对照组（control group,CN）,PAAF注射组（PAAF injection group,PI）,PAAF+抗HMGB1中和抗体组（PAAF plus anti-HMGB1 neutralizing antibody injection group,PIH）和PAAF+对照lg Y蛋白组（PAAF plus control lg Y injection group,PIC）。CN组大鼠腹腔内注射8 m L生理盐水;PI组大鼠腹腔内注射8 m L的PAAF无菌上清液;PIH组大鼠腹腔注射8 m L含有200μg抗HMGB1中和抗体的PAAF无菌上清液;PIC组大鼠腹腔注射8 m L含有200μg对照抗体lg Y的PAAF无菌上清液。建立模型后,采用HE染色观察小肠组织和胰腺组织的病理学变化,全自动生化仪检测血清淀粉酶和脂肪酶活性,紫外比色法检测血清二胺氧化酶（DAO）活性,鲎试剂法检测血清内毒素水平,ELISA法检测小肠组织白细胞介素-6（IL-6）水平、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、血清中D-乳酸水平以及PAAF和血清中HMGBI水平,TUNEL法检测肠黏膜上皮细胞凋亡情况,以及RT-PCR检测小肠组织TLR4 m RNA的表达水平,免疫组化和Western blotting检测TLR4信号通路关键分子和凋亡相关蛋白的表达。结果发现,与SAP组比较,APD组大鼠小肠和胰腺组织病理损伤明显减轻,病理评分明显降低（P<0.05）,血清淀粉酶、脂肪酶和DAO活性以及TNF-α、IL-6、D-乳酸和内毒素水平也明显降低（P<0.05）。与SAP组比较,APD组小肠组织TLR4、髓样分化因子88（My D88）、核因子-κB（NF-κB）p65、TNF-α和IL-6的表达明显降低（P<0.05）。此外,APD组小肠黏膜上皮细胞凋亡指数、cleavedcaspase-3和Bax的表达较SAP组明显降低,Bcl-2的表达明显升高（P<0.05）。与CN组相比,PI组的血清HMGB1水平显著升高（P<0.05）。通过在PAAF中加入中和抗体抑制HMGB1,与PI组相比,PIH组血清中的HMBG1水平显着降低（P<0.05）。注射8小时后,与MAP对照组相比,PI组TLR4,My D88和NF-κBp65磷酸化水平显著升高。当用抗HMGB1中和抗体处理时,与PI组相比,PIH组的TLR4信号通路被明显抑制。上述研究结果表明,在SAP早期,实施APD对肠道具有显著的保护作用,具体表现在减轻肠道组织炎性反应和伴随的粘膜细胞凋亡,改善肠道屏障功能;其次,APD通过引流出富含HMGB1的PAAF,减少吸收再入血,可明显降低其循环水平,进而减轻HMGB1所介导的肠道组织TLR4/NF-κB信号通路的激活,以此发挥对肠道的保护作用。