[目的]鼻咽癌是我国南方的一种常见的头颈部肿瘤,有转移早和易复发的特点,局部复发及远处转移的晚期鼻咽癌患者预后仍不乐观。进一步揭示鼻咽癌复发及转移的分子机制对于鼻咽癌的治疗以及生存率的提高具有重要意义。肿瘤的转移是一个连续的动态过程,涉及多个阶段的多种因素相互作用。肿瘤对基底膜的侵犯是其中的关键步骤,涉及细胞形态变化、基质降解酶的分泌、细胞迁移等多个事件。上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)则是肿瘤细胞获得侵袭和转移能力的一种重要途径。长链非编码RNA(lncRNA)是一类重要的调控RNA,近年来的研究表明他们与多种人类疾病特别是肿瘤有密切关系。己发现多种lncRNAs在人类癌症中表达失调,表现出促癌或抑癌基因的作用。H19是早期发现的lncRNAs之一,在多种肿瘤中异常高表达,调控肿瘤的增殖、凋亡、侵袭和EMT。H19在低分化的鼻咽癌肿瘤细胞中高表达,而在高分化的肿瘤细胞中低表达,暗示H19可能与鼻咽癌的分化和转移有关,但是H19对于鼻咽癌细胞的侵袭转移到底有何影响还未见报道。最近研究发现,H19可以与EZH2作用,促进膀胱癌转移。值得注意的是,EZH2也在鼻咽癌中高表达,而且同样是集中在低分化的鼻咽癌细胞,另外考虑到EZH2是一个重要的肿瘤转移相关基因,我们推测在鼻咽癌中H19可能也与EZH2存在相互作用。EZH2基因是PcG家族的重要成员之一,作为多梳抑制复合物2(PRC2)的重要组成部分,发挥组蛋白甲基转移酶活性,与肿瘤的发生发展有密切关系。近期研究表明,膀胱癌中H19能够与EZH2发生直接相互作用,直接或间接抑制E-cadherin表达,促进EMT的发生。除了直接的相互作用,文献还显示H19可以通过miRNA海绵作用调节多种microRNA(miRNA)的功能,而EZH2也受到多种miRNA的调节,那么miRNA是否参与H19对EZH2的调节也不清楚。鼻咽癌中EZH2是否同样能介导H19的作用促进肿瘤转移,值得进一步研究。因此,本研究首先利用鼻咽癌组织及细胞样本,检测了 H19和EZH2在肿瘤中的表达,分析了 H19和EZH2表达之间的关系。然后利用慢病毒介导的H19和EZH2干扰,观察了 H19和EZH2下调对于细胞侵袭的影响。最后通过进一步研究揭示了 H19调节EZH2表达的机制。[方法]1.收集31例鼻咽癌组织和30例鼻咽慢性炎组织样本,提取总RNA,经逆转录生成cDNA后,采用Realtime PCR检测H19和EZH2表达水平。将第一例鼻咽慢性炎组织设为对照,计算2-△△ct值,代表样本中H19和EZH2的相对表达量,比较肿瘤和非肿瘤组织的差异。采用Pearson相关系数分析鼻咽癌组织中H19和EZH2表达水平的相关性,并计算R2。2.培养正常鼻咽上皮细胞株NP69和鼻咽癌细胞株CNE1、CNE2和HONE1,提取总RNA,经逆转录生成cDNA后,进行RealtimePCR检测,将NP69设为对照,计算其他细胞中H19和EZH2的相对表达量,比较细胞之间的差异。提取NP69细胞、CNE1细胞、CNE2细胞和HONE1细胞蛋白,western blot检测EZH2蛋白表达水平。3.将载有 H19 shRNA 或 EZH2 shRNA 的慢病毒 Lv-H19 shRNA 或 Lv-EZH2 shRNA转染CNE2和HONE1细胞,经嘌呤霉素筛选后得到稳定克隆。Realtime PCR或western blot检测H19和EZH2表达水平确定稳定干扰H19或EZH2的CNE2和HONE1细胞建立成功。4.取常规培养的对数生长期CNE2和HONE1细胞(正常对照组,Lv-NC组和H19/EZH2干扰组)加入涂有基质胶的Transwell小室,培养24小时后检测穿膜细胞数,评估细胞的侵袭能力。5.Realtime PCR 或 western blot 检测 H19 shRNA 稳定转染的 CNE2 和 HONE1细胞中EZH2的表达水平,比较与对照的差异。6.采用RNA免疫沉淀(RIP)实验检测H19与EZH2是否有直接相互作用。首先制备载有EZH2抗体的免疫磁珠和CNE2细胞裂解液,通过免疫沉淀反应捕获裂解液中的EZH2蛋白及其RNA结合物,然后通过逆转录PCR(RT-PCR)检测H19表达,另外一组未经免疫沉淀反应的裂解液作为阳性对照,.一组IgG包被的免疫磁珠得到的沉淀物作为阴性对照。7.采 用 TargetScan(http://www.targetscan.org)、microRNA.org(http://www.microrna.org)和 miRDB(http://www.mirdb.org/miRDB)三个数据库预测 EZH2 潜在的调控 miRNA,采用 Blast 工具(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)分析这些miRNA是否存在H19的互补位点。8.Realtime PCR 检测各个 miRNAs mimics 或者 mimics 对照(mimics NC)转染细胞之后每种miRNAs的表达。9.荧光素酶报告实验验证候选miRNAs对EZH2 3’端非编码区(3’UTR)的识别。分别构建含有全长EZH2 3’ UTR的重组质粒pGL3-wt EZH23’UTR和针对候选miRNAs识别位点的EZH2 3’UTR突变载体pGL3-mut EZH2 3’ UTR,与各个miRNAs的mimics共转染CNE2细胞,同时转入海参荧光素酶载体pRL-TK作为内对照。转染48h后,裂解细胞检测荧光素酶活性,所得数据经海参荧光素酶活性矫正之后,与对照组(未转染miRNAmimics)比较。10.Pull-down和northern blot实验验证H19和候选miRNAs之间的相互作用。制备载有H19探针的磁珠,与细胞裂解液孵育,通过pull-down实验,收集H19 RNA复合物,再将miR-101和miR-630的探针分别与收集液杂交,通过northern blot实验检测收集物中是否存在目的miRNAs。11.miRNA sensor和荧光素酶报告实验检测H19对miR-630活性的影响。将miR-630上下游的互补序列插入psiCHECK双萤光素酶载体,构建miR-630 sensor。同时构建H19的表达载体pcDNA-H19,以及定点突变miR-630结合位点的pcDNA-mut H19,Realtime PCR 验证 H19 表达。miR-630 sensor 与下列因子共转染 CNE2 细胞:mimic NC、miR-630 mimics、miR-630 mimics+pcDNA-H19、miR-630 mimics+pcDNA-mut H19,另外一组 miR-630 sensor 转染 H19 稳定干扰的CNE2细胞。转染48h后,裂解细胞检测荧光素酶活性。测得的数据经萤火虫萤光素酶活性矫正后,将对照组(只转染miR-630 sensor)设为100%,计算其余组的相对荧光素酶活性,比较各组之间的差异。12.CNE2 和 HONE1 细胞用 mimic NC、miR-630 mimics 转染或者用 miR-630 mimics和 pcDNA-H19、miR-630 mimics和pcDNA-mutH19共转染。Realtime PCR和Western blot实验检测EZH2表达水平,比较各组之间的差异。13.将CNE2和HONE1细胞分为7组分别进行处理:对照组、miR-630 mimics转染组、miR-630 mimics 和 pcDNA-H 19 共转染组、miR-630 mimics 和pcDNA-mut H19 共转染组、H19 干扰组、miR-630 inhibitor 转染 H19 干扰组、.miR-630 inhibitor和Lv-EZH2 shRNA共转染H19干扰组。各组处理48h之后,采用细胞侵袭实验检测细胞侵袭能力。14.提取以上各组细胞蛋白,Western blot检测E-cadherin蛋白表达。15.Westernblot检测CNE2细胞对照组、Lv-NC组和EZH2干扰组中IKKα、p-ERK1/2、ERK1/2 和 MMP-9 的表达水平。[结果]1.鼻咽癌组织中H19和EZH2的表达水平高于鼻咽慢性炎组织的表达水平,差异有统计学意义(P<0.05)。2.高分化CNE1细胞中H19和EZH2的表达比NP69中略有上调,但没有检测到显著性差异;H19和EZH2在低分化CNE2和HONE1细胞中的表达则显著高于在NP69细胞中的表达(P<0.05)。3.与对照相比,CNE2 和 HONE1 细胞 Lv-H19 shRNA 或 Lv-EZH2 shRNA 转染组中H19或EZH2表达水平显著下降。空白对照慢病毒Lv-NC转染在两种细胞中对于H19或EZH2表达都没有明显影响。4.细胞侵袭实验结果显示,与对照相比,H19或EZH2干扰后的CNE2细胞和HONE1细胞侵袭能力显著下降(P<0.05)。5.H19和EZH2的表达在鼻咽癌组织中呈显著的正相关(R2=0.3037,P<0.01)。6.Realtime PCR和western blot结果表明,H19干扰组中的EZH2表达与对照相比,有显著下调(P<0.05)。7.RIP实验显示,未经免疫沉淀的CNE2细胞裂解液中可以扩增出H19的条带,而EZH2抗体组和IgG组都没有检测到H19表达。8.生物信息学分析得到5条miRNA,同时具有调节EZH2和与H19结合的潜力,分别是 miR-101、miR-630、miR-340、miR-559 和 miR-498。9.RealtimePCR检测显示,miRNAsmimics能上调相应miRNA的水平。10.荧光素酶报告实验结果显示,与对照相比,pGL3-wt EZH2 3’ UTR和miR-101或miR-630mimics共转染的细胞中,荧光素酶的活性显著下降(P<0.05),其他几种miRNAs mimics转染后与对照相比,荧光素酶活性没有明显变化。pGL3-mut EZH2 3’ UTR 和 miR-101 或 miR-630 mimics 共转染的细胞中,荧光素酶与对照相比没有显著差异。.11.Pull-down和northern blot结果显示,未经H19探针pull-down的细胞裂解液中能检测到miR-101和miR-630以及内参U6的存在,随机探针pull-down的细胞裂解液检测不到miR-101和miR-630存在,H19探针pull-down的细胞裂解液只检测到miR-630的阳性条带。12.Realtime PCR 检测表明,pcDNA-H19 和 pcDNA-mut H19 转染能够显著增加H19表达水平。13.miRNA sensor和荧光素酶报告实验结果显示,miR-630 mimics转染可以显著提高自身的活性(P<0.05),于此相比,miR-630和H19共转染的细胞中,miR-630活性受到显著抑制(P<0.05);miR-630+mutH19转染组和miR-630转染组相比没有显著差异;H19干扰组与对照相比,miR-630活性也显著升高(P<0.05)。14.Realtime PCR和Western blot实验结果显示,与对照相比,miR-630转染组中EZH2表达显著降低(Realtime PCR中P<0.05),H19转染能显著恢复miR-630 抑制的 EZH2 表达(Realtime PCR 中 P<0.05),突变的 H19 对 miR-630的作用没有影响。15.Realtime PCR结果显示,miR-630 inhibitor能够显著降低miR-630表达水平。16.细胞侵袭实验结果显示,与对照相比,miR-630显著抑制两株鼻咽癌细胞的侵袭能力(P<0.05);H19部分恢复了 miR-630抑制的细胞侵袭(P<0.05);突变的H19对miR-630的作用没有影响;miR-630 inhibitor显著恢复了被H19干扰抑制的细胞侵袭(P<0.05);EZH2干扰抵消了 miR-630 inhibitor的作用,重新降低了侵袭细胞的数量(P<0.05)。17.Western blot检测E-cadherin结果显示,与对照相比,miR-630能明显增加E-cadherin蛋白水平;突变的H19对miR-630的作用没有影响,野生型的H19则抑制了 miR-630上调的E-cadherin水平;H19干扰能增加E-cadherin水平,转染miR-630 inhibitor之后E-cadherin恢复低水平表达;EZH2干扰抵消了 miR-630 inhibitor的作用,重新上调了 E-cadherin表达。18.Western blot检测IKKa、p-ERK1/2、ERK1/2和MMP-9表达水平结果显示,与对照组相比,EZH2干扰之后,IKKα水平明显增加,p-ERK1/2蛋白水平降低,总ERK1/2水平无明显变化,MMP-9表达降低。[结论]1.H19和EZH2在鼻咽癌组织和低分化肿瘤细胞中高表达。H19或EZH2下调可以显著抑制鼻咽癌细胞的侵袭能力。2.鼻咽癌组织EZH2和H19的表达水平呈显著正相关,H19干扰也会抑制EZH2表达。3.鼻咽癌中H19与EZH2可能不存在直接相互作用。H19通过序列特异性的结合miR-630,抑制miR-630活性,从而增加其靶基因EZH2表达。4.H19通过miR-630/EZH2通路促进细胞侵袭,下游可能涉及到E-cadherin表达抑制或者IKK α/ERK通路介导的MMP-9上调。