5-氨基乙酰丙酸(ALA)作为所有吡咯化合物(例如血红素、维生素B12、叶绿素)的前体物质,在农业和医学领域具有广阔的应用前景。农业上,ALA促进光合作用和组织分化,能够选择性杀死双子叶植物的杂草而对农作物无害,增强植物的抗寒性和耐盐性；医学上,作为光动力学药物,在诊断和治疗癌症方面效果显著,在霉菌病和风湿性关节炎等疾病治疗中的作用逐步被认可,对美容和护肤也有一定功效,具有很好的实际应用价值和工业前景。传统的ALA化学合成法成本高、收率低、价格昂贵且造成严重的环境污染问题。生物合成法合成ALA具有生产过程简单、生产潜力大且对环境友好等特点。ALA的生物合成主要有两条途径：一条C5途径,由本实验室首次构建,以葡萄糖为唯一碳源在大肠杆菌中发酵生产ALA,但该途径涉及的酶较多,代谢调控复杂,且产量提高有难度；另一条是C4途径,以琥珀酰-CoA和甘氨酸为前体,由于其途径较短,调控简单而被广泛研究。然而昂贵的前体物质琥珀酰-CoA和甘氨酸的添加、好氧发酵过程对通气量和搅拌的较高要求使得生产成本较高。如何对C4途径进行优化,从而提高ALA产量和产率,降低生产成本成为本论文研究的重点。本论文首先在好氧条件下对C4途径进行了优化,包括选取不同遗传背景的大肠杆菌进行好氧发酵,比较其ALA生产能力及菌株代谢的不同；在提高溶氧条件下对不同遗传背景菌株的ALA生产能力进行比较；进一步对不同来源ALA合酶的筛选优化。结果表明不同遗传背景的大肠杆菌菌株生产ALA的能力差别较大,生长情况也有很大不同；在能同时分解脂肪酸和葡萄糖的KNSP菌株中表达来源于红假单胞菌KUGB306的ALA合酶时,摇瓶发酵ALA产量达到3.61g/l,且该菌株生长较好,活力旺盛。本部分研究首次清晰地证实了利用重组大肠杆菌生产ALA的能力依赖于所选用的菌株背景,不同基因型的大肠杆菌由于代谢通量不同,ALA合酶的活力不同,ALA向下游转化的趋势也不尽相同,从而导致ALA产量有较大差别。本论文进一步在大肠杆菌中建立了微好氧和好氧-厌氧双阶段发酵生产ALA的策略。利用本实验室已有的好氧-微好氧-厌氧琥珀酸高产菌YL106,该菌株能够积累大量琥珀酸,且副产物如乳酸、乙酸等很少,进而为ALA的生产提供丰富的前体,通过表达来源于类球红杆菌的ALA合酶得到YL106A菌株,该菌株微好氧摇瓶条件下能够积累5.88 g/1 ALA,产率为0.557 g ALA/g glucose,将该菌株进行5L罐发酵优化,ALA产量达到7.67g/l；为验证由琥珀酸向琥珀酰-CoA转化是否限速,尝试在该菌中过表达cat1或sucCD,发现cat1的过表达能够明显提高微好氧下ALA产率和生产速率,利用该菌进行低溶氧发酵有望降低通气和搅拌的生产成本,简化下游分离提取工艺。本论文最后一部分尝试以葡萄糖为唯一碳源合成前体琥珀酸和甘氨酸,最终实现由葡萄糖直接合成ALA,以降低C4途径生产成本。本实验室前期构建的丝氨酸产生菌能够积累一定量的丝氨酸(4.5g/l),且流向甘氨酸的通量较大,而甘氨酸是ALA合成的两种前体之一。进一步在丝氨酸产生菌3Sp中敲除sucD,使得另一种前体琥珀酸不需外源添加。然后通过过表达ALA合酶,实现ALA的积累。同时我们还探究了不同来源的ALA合酶对ALA积累能力的影响,并且优化了丝氨酸合成途径相关的辅因子,如叶酸、磷酸吡哆醛、谷氨酸,最终得到一株大肠杆菌工程菌5SRPO,该菌株无需添加任何前体,以葡萄糖为唯一碳源时,摇瓶下能够积累约0.21g/l的ALA。该部分首次建立了以葡萄糖为唯一碳源的ALA发酵策略,摆脱了现有技术中对琥珀酸和甘氨酸前体的依赖,将显著降低ALA的生产成本。以上研究结果及成功构建的大肠杆菌工程菌株,为进一步提高ALA产量和产率,降低生产成本提供了良好的研究基础和新的研究思路。