撑×绿杂交竹梢枯病是四川杂交竹栽培区新发现的重要病害,可使竹林成片枯死,危害极大。本文基于生物防治原理,从四川撑×绿杂交竹梢枯病发病区的健康植株上分离放线菌,以梢枯病菌为靶标筛选具有生防潜能的抗生体,通过发酵条件优化、抗菌谱以及防治效果测定验证其生防功能。在此基础上,分离纯化了目标生防菌发酵滤液中的有效抗菌物质,研究了抗菌蛋白对杂交竹的诱导抗病性以及对梢枯病菌的作用机制,并克隆了抗菌蛋白相关基因,获得以下主要结果：1.弄清杂交竹放线菌资源的微生态分布及抑菌活性,可为杂交竹梢枯病生物防治提供新的资源。本试验分别采用组织块洗涤法和匀浆法分离梢枯病发病区健康杂交竹附生和内生的放线菌,通过平板对峙试验初筛、离体枝叶接种和田间病害防治试验复筛获得最优生防菌株,并通过形态特征、培养特性、生理生化特性、细胞壁组分与16S rDNA序列分析进行鉴定。结果表明：共分离得到96株放线菌,链霉菌占总数的93.75%,属于8个不同类群,另有小单孢菌(Micronnospora)和诺卡氏菌(Nocardia);菌株YSSPG3抑菌作用最强,GN32次之；二者的活体菌剂在离体枝叶上的防治效果显著高于其他处理；在田间,二者均有很好的防治效果,以菌株YSSPG3的效果最好,在叶和枝上的防效分别为80.08%和81.02%；经鉴定,菌株YSSPG3为绛红褐链霉菌(Streptomyces purpeofuscus),菌株GN32为加利福尼亚链霉菌(Streptomyces californicus)。2.采用单次单因子设计、正交试验设计对绛红褐链霉菌YSSPG3的发酵培养基配方及培养条件进行了优化,并测定了摇瓶发酵过程中的主要代谢参数,以期能够提高发酵液中抑菌活性成分的含量,为其在生产中的应用奠定基础。结果表明：最优培养基组成为：葡萄糖5g、甘油5g、黄豆饼粉3g、蛋白胨5g、NaCl2.5g、CaCO22g、蒸馏水1000mL。将培养基的初始pH值调至7.0、108cfu/mL孢子悬浮液接种量为1%(V/V)、装瓶量100mL/300mL、25℃恒温摇床140r/min培养4天,菌株YSSPG3的抑菌活性最好。菌株YSSPG3在发酵过程中产生碱性物质,生长量和抗菌活性物质产量在96h时达到最大值,培养基中总糖、还原糖和氨基氮的含量在36h后逐渐减少,特别是在菌体的对数生长期和稳定期(72-96h)含量都急剧下降。3.通过分生孢子萌发、菌丝抑制试验、离体枝叶接种及田间病害防治试验,研究了绛红褐链霉菌YSSPG3的优化发酵培养滤液对杂交竹梢枯病的防治效果。结果表明：发酵滤液对病原菌分生孢子萌发及菌丝生长均有明显的抑制作用,可导致芽管、菌丝畸形。去菌发酵原液及其10倍稀释液处理离体枝叶能有效抑制病斑扩展,接种后4天的防治效果在70%以上。田间喷施去菌发酵原液及其5倍稀释液防治效果均达80%以上,显著高于化学药剂50%多菌灵WP(30mg/mL)和70%甲基硫菌灵WP(30mg/mL)(P<0.01).4.为明确绛红褐链霉菌YSSPG3发酵滤液中有效抗菌物质的性质,本试验采用硫酸铵沉淀和柱层析法对发酵滤液中起主要抑菌作用的抗菌物质进行分离纯化,获得单一的抗菌蛋白AMP,分子量为5075.619Da,等电点为6.77。抗菌蛋白在温度≥60℃和pH<7,以及紫外线照射时间≥12h的环境下抑菌活性均明显下降,但受蛋白酶K、胰蛋白酶和氯仿影响不大,无几丁质酶、葡聚糖酶等水解酶活性。对子囊菌门、半知菌门腔孢纲和丝孢纲的多种植物病原真菌具有抑菌活性。利用Edman降解法测定抗菌蛋白N末端25个氨基酸序列,与来自Streptomyces tendae Tu901的几丁质结合蛋白(chitin-binding protein) AFP1的同源性达81.00%。5.为全面揭示抗菌蛋白(AMP)对杂交竹梢枯病的抗病机制,采用抗菌蛋白梯度稀释液喷雾或浸根诱导处理杂交竹苗,并调查其病情指数以及测定杂交竹体内可溶性蛋白含量、丙二醛(MDA)含量、抗性相关酶活性的时序变化。结果表明,用抗菌蛋白(母液浓度为360.56μg/mL)的10倍、20倍、50倍、100倍稀释液叶片喷雾或浸根诱导杂交竹抗性,其植株内可溶性蛋白和丙二醛(MDA)含量,以及超氧化物歧化酶(SOD)、多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、几丁质内切酶和β-1,3-葡聚糖酶等抗性酶对杂交竹梢枯病菌有不同的响应。诱导并挑战接种处理的叶片内可溶性蛋白含量、丙二醛含量、以及各抗性酶活性比只诱导不接种的处理上升幅度大。只诱导不接种及诱导后挑战接种,叶片内各抗性酶的活性与抗菌蛋白浓度呈正相关。POD、PPO、CAT三种酶活性用浸根处理的时序变化幅度及同时期升高幅度大于喷雾处理,而β-1,3-葡聚糖酶活性则相反；SOD、PAL和几丁质内切酶的差异不明显。各抗性相关酶活性与病情指数的相关性分析表明,抗病性在喷雾诱导处理中与PPO、POD、CAT和β-1,3-葡聚糖酶活性相关性显著,在浸根诱导处理中与SOD、PALn几丁质内切酶和β-1,3-葡聚糖酶活性相关性显著,说明抗性酶与病情指数的变化存在内在的关联性。6.为探明抗菌蛋白(AMP)对杂交竹梢枯病菌的抑菌作用机理,通过菌丝超微结构观察、细胞膜透性测定、菌丝可溶性蛋白含量测定、细胞壁成分红外光谱测定、DNA电泳观察等对抗菌蛋白的抑菌活性及其机制进行研究。结果表明,抗菌蛋白对杂交竹梢枯病菌的抑菌中浓度为0.132μg/mL,最小抑菌浓度为3.606μg/mL,最小杀菌浓度为18.028μg/mL,浓度高于1.202μg/mL时,对病原菌菌丝生长和孢子萌发的抑制率均达到80%以上。经抗菌蛋白处理后,分生孢子萌发缓慢,芽管的生长极性发生改变,菌丝异常肿大,发生强烈变形,细胞壁不规则增厚,菌丝顶端表现最为明显,原生质不均匀,甚至出现空泡；菌丝的细胞膜透性增大,膜脂质过氧化作用增强,可溶性蛋白含量下降,DNA未受损伤；细胞壁葡聚糖结构无明显变化,几丁质结构-OH伸缩振动、C-H伸缩振动和弯曲振动吸收强度都明显降低,而p-型糖苷键和环上碳-氧(C-O)的特征吸收峰,以及醇羟基的变角振动吸收峰的吸收强度明显增大。7.利用已测得的N-末端氨基酸序列及其同源序列,设计简并引物。以绛红褐链霉菌YSSPG3基因组DNA为模板,扩增得到223bp的特异性条带(amp)。同源性比较发现,序列amp与来源于S. clavuligerus ATCC27064的几丁质结合蛋白编码基因同源性为83.4%。与来源于S. Tendae Tu901的同源性为79.8%。由序列amp翻译的氨基酸序列与N-末端氨基酸测序结果吻合,与来源于S. Tendae Tu901的几丁质结合蛋白的同源性达78.1%。