钙化性主动脉瓣疾病是一个慢性进展性疾病,包括早期的主动脉瓣硬化(aortic sclerosis, ASc)和晚期的钙化性主动脉瓣狭窄(calcific aortic valve stenosis, CAS)。在欧、美等发达国家,CAS己成为成人最常见的心脏瓣膜病；且患者一旦出现临床症状,预后较差。随着研究的深入,对CAS的认识逐渐从“与年龄相关的退行性过程”过渡到认为其是“主动调节的慢性炎症过程”。临床来源的的主动脉瓣标本数量有限,且钙化较严重；用猪、兔等建立的动物模型,耗时较长且较繁琐,故建立有效的体外疾病模型显得尤为重要。主动脉瓣间质细胞(aortic valve interstitial cells,AVICs)在CAS发生发展中起重要作用。目前用于CAS研究的AVICs多来源于猪,但由于缺乏相应一抗,使研究受限。在有关CAS的体外研究中,多通过不同种类或浓度的钙化诱导剂或刺激因子诱导AVICs钙化,这使得试验间结论的可比性较差。SD大鼠是一种常用的实验动物,具有体积小、易饲养、易购买等优点。目前以SD大鼠为研究对象对CAS进行的研究较少,可能与大鼠主动脉瓣较小,不易分离培养有关。本研究欲分离培养SD大鼠AVICs,并观察其在未给予钙化诱导剂或刺激因子的情况下,随着培养时间的延长是否自发形成钙化灶；并检测钙化过程中钙化相关因子的表达情况,同时观察阿托伐他汀及氨氯地平对自发钙化的影响。第一部分SD大鼠主动脉瓣间质细胞分离培养目的：建立快速有效的SD大鼠AVICs体外培养方法。方法：通过组织块法分离培养SD大鼠AVICs,观察细胞原代及传代后生长特性；并通过IF染色方法检测a-SMA及vimentin表达情况；通过SEM和TEM对细胞表面和内部结构进行观察。结果：1原代培养2-3天后,部分组织块周边有细胞爬出,呈梭形、三角形或不规则形；原代培养7～8天后,细胞可达到70～80%融合,进行传代。2AVICs经IF检测阳性,即SD大鼠AVICs表达a-SMA及vimentin。3经SEM检测可见,细胞贴壁良好,多边形,体积较大,细胞膜较薄且充分伸展。4经TEM检测可见,细胞体积较大,不规则形,可见绒毛；胞内细胞器丰富,可见大量扩张的粗面内质网及与细胞长轴平行的肌丝；细胞核不规则,可见核仁。结论：1通过组织块法对SD大鼠AVICs进行培养,方法简单快速。2经过形态学、细胞免疫学鉴定,SD大鼠AVICs为肌成纤维细胞。第二部分SD大鼠主动脉瓣间质细胞自发钙化模型的建立目的：观察体外分离培养的SD大鼠AVICs是否可以自发形成钙化灶。方法：通过组织块法分离培养SD大鼠AVICs,对不同培养时间的AVICs进行Von Kossa及茜素红染色、细胞内及其间质钙离子检测,’评价其是否可以自发形成钙化灶。结果：1培养至4～6天时,AVICs逐渐聚集成团,称为“细胞灶”,此时细胞灶较小,散在分布；随着培养时间的延长,细胞灶体积逐渐增加,中心区亮度增加。2Von Kossa染色显示,6天时细胞灶染色阳性,即细胞灶处有钙盐沉积；并且12天时阳性细胞灶个数及强度均大于6天组。3茜素红染色显示,6天时细胞灶染色阳性,即细胞灶处有钙盐沉积；并且12天时阳性细胞灶个数及强度均大于6天级。经统计分析显示,茜素红含量组间有统计学差异(F106.167,P<0.001),0天及6天组茜素红含量较低,12天组茜素红含量较高,即随着培养时间的增加钙盐沉积增加。4细胞及间质钙含量经统计分析显示,钙离子含量组间有统计学差异(F116.379,P<0.001),0天及6天组钙离子含量较低,12天组钙离子含量较高,即随着培养时间的增加钙盐沉积增加。结论：通过延长细胞培养时间能够诱导其自发形成钙化灶。第三部分SD大鼠主动脉瓣间质细胞自发钙化模型的机制研究目的：检测AVICs在自发钙化过程中某些成骨相关基因的表达情况。方法：通过组织块法分离培养SD大鼠AVICs,用RT-PCR和western-blot方法,检测不同培养时间细胞的ALP活性、成骨相关因子(a-SMA、Cbfal、Osteocalcin、ALP、BMP-2、BMP-4) mRNA及蛋白表达情况。结果：1ALP活性检测结果表明,0天、6天、12天组ALP活性有统计学差异(χ2=139.396,P<0.001),12天组ALP活性最低,0天组ALP活性较高,6天组ALP活性最高,即随着培养时间的增加,ALP活性从0天开始逐渐升高,至第6天达峰,之后逐渐下降。2Cbfal mRNA、Osteocalcin mRNA、BMP-4mRNA、ALP mRNA、BMP-2mRNA、α-SMA mRNA RT-PCR检测结果2.1Cbfal mRNA、Osteocalcin mRNA、BMP-4mRNA RT-PCR结果表明,0天、6天、12天组Cbfal mRNA、Osteocalcin mRNA、BMP-4mRNA表达水平有统计学差异(F=410.106,χ2=7.200,F=38.463,P<0.005),0天组最低,6天组较高,12天组最高,即随着培养时间的增力(?)Cbfal mRNA、 Osteocalcin mRNA、BMP-4mRNA表达水平逐渐增高。2.2ALP mRNA RT-PCR结果表明,0天、6天、12天组ALP mRNA表达水平有统计学差异(χ2=7.200,P=0.027),0天最低,12天较高,6天最高,即随着培养时间的增加,ALP mRNA的表达水平先增加后下降。2.3BMP-2mRNA RT-PCR吉果表明,0天、6天、12天组BMP-2mRNA表达水平有统计学差异(F=56.565,P<0.001),0天组较低,6天组和12天组较高,即随着培养时间的增加,BMP-2mRNA的表达水平逐渐增加。2.4a-SMA mRNA RT-PCR结果表明,0天、6天、12天组a-SMA mRNA表达水平有统计学差异(F=89.886,P<0.001),12天最低,6天较高,0天最高。随着培养时间的增加a-SMA mRNA的表达水平逐渐下降。3ALP、BMP-2、BMP-4western-blot结果3.1ALP western-blot结果表明,0天、6天、12天组ALP蛋白表达水平有统计学差异(χ2=7.261,P=0.027),0天组最低,12天组较高,6天组最高,即随着培养时间的增加,ALP蛋白表达先增高后降低。3.2BMP-2、BMP-4western-blot结果表明,0天、6天、12天组BMP-2、BMP-4蛋白表达水平有统计学差异(χ2=7.200,F=452.482,P<0,05),0天组最低,6天组较高,12天组最高,即随着培养时间的增加BMP-2、BMP-4蛋白表达逐渐增高。结论：AVICs向成骨细胞表型转化可能是自发钙化模型形成的细胞学基础。第四部分阿托伐他汀和氨氯地平对SD大鼠主动脉瓣间质细胞自发钙化的影响目的：观察阿托伐他汀和氨氯地平对SD大鼠AVICs自发钙化的影响。方法：采用组织块法分离培养SD大鼠AVICs,检测不同浓度的阿托伐他汀和氨氯对平对AVICs自发钙化程度及ALP活性的变化情况。结果：1通过延长培养时间,各组均形成直径大小不同的钙化灶。2Ato和Aml对AVICs自发钙化程度的影响2.1在控制了组别因素的情况下,时间因素在不同水平有统计学差异：0天和6天较低,12天较高(F=116.379,P<0.001),髓着培养时间的增加各组Ca2+含量均逐渐增高。2.2在控制了时间因素的情况下,组别间有统计学差异,10-6mol/L Aml组比10-6mol/L Ato组钙含量高,两组间有统计学差异(F=3.655,P=0.023),其他组间均无统计学差异,即在相同的培养时间情况下,除10-6mol/L Aml组和10-6mol Ato组Ca2+含量有差别外(10-6mol/L Aml组Ca2+含量高于10-6mol/L Ato组),其余各组均无差别。3Ato和Aml对ALP的影响3.1在控制了组别因素的情况下,时间因素在不同水平有统计学差异：12天最低,0天较高,6天最高(F=139.396,P<0.001),即随着培养时间的增加各组ALP活性先增加后降低。3.2在制了时间因素的情况下,组别间无统计学差异(F=0.515,P=0.675),即在培养时间相同的情况下,不同浓度的药物对ALP活性变哈无影响,结论：11×10-7～1×10-6mol/L浓度的Ato对SD大鼠AVICs钙化无明显影响。21×10-7～1×10-6mol/L浓度的Aml对大鼠AVICs钙化无明显影响。