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目的：幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H. pylori)为人类胃部疾病的重要致病菌之一,世界范围内感染率达到50%。Ⅰ型H. pylori菌株因携带cag致病岛(cag pathogenicity island, cag-PAI)而致其毒性较强,流行病学研究显示：Ⅰ型菌株与多种胃肠道疾病的发生关系更为密切。cag致病岛编码的Ⅳ型分泌系统能够合成并转运-细胞毒素相关基因A蛋白(Cytotoxin-associated gene A, CagA)进入到宿主细胞内导致细胞功能紊乱。目前已知致病岛可编码27种蛋白,但多数蛋白的功能尚未十分清楚。本文选择了致病岛中的hp0520作为研究对象,通过微生物学、分子生物学、免疫学和生物信息学等技术探讨hp0520基因的功能,为深入研究cag致病岛的功能和致病机制奠定基础。方法：1.根据Genbank收录的H. pylori26695全基因序列,利用Primer Premier6.0设计hp0520全长克隆基因引物,通过T-A克隆的方法,获得目的基因片段并测序；并对序列进行生物信息学分析研究。2.构建原核表达载体pET-32a-hp0520,并转化入表达工程菌Rosetta (DE3);经IPTG诱导后,使用QIAGEN系统Ni2+-NTA柱纯化获得融合蛋白。经SDS-PAGE电泳、Western blot分析和质谱方法鉴定目的蛋白。3.纯化后的HP0520融合蛋白免疫BALB/c小鼠,利用细胞融合技术将免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)融合获得杂交瘤细胞；通过数轮亚克隆和间接ELISA筛选能稳定分泌单克隆抗体(monoclonal antibody, mAb)的杂交瘤细胞；腹腔接种阳性杂交瘤细胞于BALB/c小鼠,制备腹水型mAb,并进行纯化；用ELISA法鉴定mAb的免疫球蛋白类型；间接ELISA法测定杂交瘤细胞培养上清、腹水的抗体效价；间接ELISA法和Western blot法鉴定mAb与抗原的反应特异性。4.利用同源重组原理,构建hp0520基因缺陷自杀质粒pBlueKM40-△hp0520::Kmr,电转化进入H. pylori NCTC11637中,通过抗性筛选和PCR及Western-blot方法验证,获得hp0520基因缺失株。5.收集并裂解H. pylori NCTC11637细菌菌体,使用超高速低温离心方法得到不同的亚细胞组分：膜组分(包括内膜和外膜)、胞质组分和周质组分,使用Western-blot方法,检测HP0520蛋白亚细胞定位；同时将h. pylori NCTC11637与胃上皮细胞GES-1共培养后,分离GES-1细胞组分成细胞膜蛋白和细胞浆部分,检测共培养后HP0520蛋白能否进入GES-1细胞中。6.利用细菌双杂交体系,寻找cag致病岛中与HP0520蛋白具有相互作用的可疑蛋白。收集并裂解hp0520基因缺失株与野生株,用Western-blot方法检测cag致病岛编码蛋白CagX、CagM、CagL和CagA,研究hp0520基因对这些蛋白稳定性的影响。7.将hp0520基因缺失株与野生株分别与胃上皮细胞GES-1共培养后,检测其对细胞形态,细胞因子分泌和CagA蛋白转运的影响。结果：1. H. pylori NCTC11637菌株hp0520基因全长为348bp,编码蛋白长度为115aa,其相对分子质量为12.42kDa,等电点为8.58。该蛋白属于稳定且亲水性的蛋白。在蛋白两端存在多个亲水区域,而蛋白的中段则是疏水的跨膜区域。预测该蛋白存在信号肽,位置在N端的前21个碱基,在21至22的位置处断裂。并且存在一个跨膜区域,位于蛋白中段,两端亲水,极可能游离于膜外。系统进化树分析表明H. pylori NCTC11637菌株的hp0520基因与hpEurope DU52:2及hpEurope101UK位于同一分支,同源性最高。2.构建原核表达载体pET-32a-hp0520,通过IPTG诱导及QIAGEN系统纯化获得大量目的蛋白。3.将纯化后的蛋白免疫小鼠获得了一株鼠抗HP0520融合蛋白的单克隆抗体HP20-1,效价为1：3.2×105。4.成功构建hp0520基因敲除重组自杀质粒：pBlueKM40-△hp0520::kan。电转化自杀质粒进入H. pylori NCTC11637菌体内,通过卡那霉素抗性筛选及PCR、 Western-blot验证得到H. pylori hp0520基因缺失株：Ahp0520。5.以单克隆抗体HP20-1为一抗作Western-blot分析,确定H. pylori在自然情况下会合成HP0520,且HP0520位于菌体膜部分,不会通过分泌进入到细胞内。6.细菌双杂交结果筛选到HP0521、HP0525、HP0526及HP0538与HP0520蛋白具有相互作用。7.比较H. pylori野生株和△hp0520基因缺陷株中四种已知Cag-TFSS重要的外膜结构蛋白及效应蛋白的表达情况。结果显示缺失株中CagX、CagM、CagL和CagA蛋白表达水平与野生株没有明显差异。8.H. pylori与GES-1细胞共培养,检测细胞形态、CagA蛋白转运量及细胞因子分泌,结果显示hp0520基因缺失株可抑制CagA转运及细胞因子的分泌。结论：1.成功克隆了hp0520全长基因,使用生物信息学方法了解其编码蛋白的理化性质,并预测了其存在信号肽和跨膜区域。2.确定了HP0520蛋白的亚细胞定位,位于菌体膜部位,且不能分泌进入细胞。3.证明了HP0520蛋白可能与]HP0525、HP0526及HP0538构成TFSS的内膜蛋白具有相互作用,hp0520缺失后对CagX、CagM、CagL位于TFSS外膜蛋白和CagA效应蛋白的稳定性没有影响,说明HP0520蛋白位于细菌的细胞内膜上。4.证明了hp0520基因缺失后使H. pylori刺激细胞分泌细胞因子的能力明显下降与空白对照组一致,CagA蛋白转运能力也明显下降但并没有完全消失,说明hp0520基因参与TFSS诱导细胞因子分泌及CagA转运过程,结合亚细胞定位结果证明HP0520蛋白在Ⅳ型分泌系统中是位于内膜上的结构蛋白。