盾壳霉(Coniothyrium minitans)是植物病原真菌核盘菌属真菌(Scelrotinia spp.)的专一性重寄生真菌,由于其对动植物安全且与核盘菌所需生长环境一致,是防治作物菌核病的重要生防真菌。本文通过二代、三代测序技术,对盾壳霉ZS-1菌株进行了全基因组de novo拼接;并结合盾壳霉与核盘菌接触不同时期RNA＿seq数据,分析了盾壳霉重寄生机制进行。主要结果如下:1.本文获得盾壳霉组装基因组大小为39.77 Mb,预测转录基因11437个,编码蛋白11437个。全基因组进化分析显示,盾壳霉与球孢菌(Paraphaeosphaeria sporulosa)基因组进化亲缘关系最近。ITS多序列比对分析可知,两种真菌的ITS碱基差异主要T、C碱基的不同。基因组组分分析显示,盾壳霉和球孢菌等两种真菌基因组转录的snc RNA和t RNA等非编码RNA的数目和种类分布较为相似;二者编码的sn RNAs数目与3种木霉菌(Trichoderma spp.)的数目接近,少于其它所分析真菌基因组编码的数目;而t RNA数目少于本研究中所分析的木霉菌和大部分病原真菌。2.比较分析了盾壳霉ZS-1与38株其它真菌基因组在碳水化合物酶类(CAZymes)、分泌蛋白、转运子和编码次级代谢产物合成基因簇等方面的异同。盾壳霉编码CAZymes中的细胞壁降解酶在盾壳霉降解核盘菌细胞壁扮演重要的角色。盾壳霉基因组编码细胞壁降解酶类与同目(order)真菌在种类分布上具有显著目属特异性;其中盾壳霉中植物细胞壁降解酶类(PCWDE)均有相同的分布趋势,然而基因组中的真菌细胞壁降解酶类(FCWDE)的种类分布不一致,不具有目属特异性。盾壳霉编码的24个铜依赖的裂解多糖单氧化酶(AA9),相对于3种木霉菌(Trivi2、Triha1和Triat2各编码3个)、2种核盘菌(Sclsc2和Sclbo1各编码6个)、3种灰葡萄菌(B05.10、Bc DW1和Bc T4各编码10个)编码数目呈现显著的扩张。与木霉菌基因组编码的CAZyme相比,盾壳霉在AA9、AA7、GH5、GH35、GH43、PL1、PL3等偏向于PCWDE的CAZyme家族上的数目增多,而木霉菌则在GH18、GH55、GH64、GH71、GH75、GT69、GT70、PL20等家族的CAZyme数目显著扩张。盾壳霉的生命活动的过程,涉及大量的物质转运,转运子尤其是MFS和ABC家族转运子蛋白在生物体物质转运过程中发挥关键性的作用。研究表明盾壳霉产孢和重寄生过程中,转运子活性(transporter activity,GO:0005215)分子功能和转运(GO:0006810)生物过程相关基因表达显著富集(P≤0.05)。单羧酸转运蛋白(Moncarboxylate Transporter,MCT)数目在盾壳霉(16个)、球孢菌(18个)以及3种木霉菌基因组呈现明显的扩展。ABC转运子家族的重金属转运蛋白数目(7个)与本文中所分析的其它真菌(编码3-4个)相比呈现显著的扩张。分泌蛋白是一类分泌到细胞外参与生命活动重要蛋白质。预测盾壳霉基因组编码胞外分泌蛋白948个,占编码蛋白总数的8.29%,与文中分析的其它真菌相比在蛋白占比上没有显著性差异;进一步研究表明它们都具有胞外分泌特性。盾壳霉胞外分泌蛋白主要集中在催化活性(Catalytic activity)、碳结合(Carbohydarate binding)和抗氧化活性(Antioxidant activity)等分子功能以及碳代谢(Carbohydrate metabolic process)和多糖代谢(Polysaccharide metabolic process)等生物过程。结合基于LCMS/MS的蛋白质鉴定结果,从盾壳霉基因组中克隆了6个编码效应子类似分泌蛋白基因,分别在核盘菌中表达引起核盘菌菌落形态的差异,且菌落形态不稳定;而去除了信号肽序列的CDS在核盘菌中表达转化子间菌落形态差异不明显。盾壳霉编码的效应子类似蛋白基因表达影响寄主的菌落表型,推测盾壳霉分泌蛋白在重寄生作用过程发挥重要的功能。真菌合成的聚铜化合物由在基因组上成簇存在编码的一系列聚酮合酶重复脱羧合成,部分具有显著的抗细菌(ABS)或抗真菌活性(AFS),是真菌次生代谢产物的重要组成部分。盾壳霉基因组预测编码6个PKS基因簇,其数目显著少于近缘属真菌球孢菌(16个)和所有其它分析的植物病原真菌(12-16个)和生防真菌(12-20个)编码的个数,但是多于灰葡萄菌Bc T4基因组编码的4个PKS基因簇。3.盾壳霉全生长发育可大致分为分生孢子(Cop)、分生孢子萌发期(Spg)、菌丝生长期(Myp)、菌丝生长后期/分生孢子器产生前期(Lmy)和分生孢子产生成熟期(Com)等5个时期,基于RNA-seq分析了盾壳霉分生孢子萌发期、菌丝生长期和产孢期的基因调控机制。在分生孢子萌发期,盾壳霉在蛋白翻译、氧化磷酸化、氨基酸相关酶类、细胞骨架、能量代谢、谷胱甘肽代谢等通路(KEGG pathway)显著富集(P≤0.05)。在菌丝生长阶段,信号和细胞过程、氮代谢、酪氨酸代谢、外泌体、碳水化合物代谢、转运子以及转运等相关通路显著富集(P≤0.05)。而碳水化合物代谢、其它次级代谢产物生物合成、淀粉和糖代谢、转运子、丙酮酸盐、氨基糖和核苷酸糖代谢通路(P≤0.05)则被显著富集参与盾壳霉分生孢子的产生。4.为更好地明确盾壳霉寄生核盘菌的生物学过程,解析了盾壳霉菌丝与核盘菌菌丝接触0 h、4 h和12 h等三个时间点RNA-seq数据。与二者刚接触时期相比,盾壳霉在寄生核盘菌的4 h和12 h,分别有622个和875个基因显著上调表达,共有上调表达443个。盾壳霉在“感知”到核盘菌存在时,上调自身多个相关基因参与重寄生过程。细胞通讯(GO:0007154)、应激生物过程(GO:0065007)、转运子(GO:0006180)、底物定位过程(GO:0051179)、杂环化合物和有机物生物合成过程在盾壳霉与核盘菌接触早期的4 h和12 h分别与0 h比较中显著富集(P≤0.05)。基于以上生物过程与分子功能可以推测,盾壳霉在接触核盘菌后,通过信息的交流(GO:0007154)识别核盘菌,提高与有机环状化合物结合(GO:0097159)、杂环有机化合物结合(GO:1901363)、小分子物质结合(GO:0036094)、药物结合(GO:0008144)、蛋白结合(GO:0005515)和离子结合(GO:0043167)等结合以及转运子活性(GO:0005215)相关基因的表达,并且水解酶活性(GO:0016787)相关基因表达在12 h显著富集(P≤0.05)。盾壳霉基因组编码中大部分涉及到了编码细胞壁降解酶类、转运子、分泌蛋白和次级代谢产物合成基因簇的DEGs,在盾壳霉接触核盘菌早期显著上调表达。在另一方面,在盾壳霉重寄生核盘菌过程中,核盘菌也有相应的应答反应,如核盘菌中有关创伤修复氧化还原过程(GO:0055114)、芳香族氨基酸合成过程(GO:0009073)和分支酸盐生物合成途径(GO:0009423)等生物学过程以及氧化还原活性(GO:0016491)、耐热耐压应激(GO:0006950,GO:0009408)、胆碱脱氢酶活性(GO:0008812)和氧化应激(GO:0016884)等功能相关基因表达被显著抑制。与此同时,核盘菌中苯丙氨酸合成通路以及其涉及到莽草酸产生相关基因表达在盾壳霉早期寄生的核盘菌中被显著抑制。5.核盘菌菌丝接触盾壳霉后,核盘菌诱导坏死蛋白(Ss NEP2)基因Ss NEP2表达显著增强,通过ATMT技术获得了该基因在核盘菌中沉默转化子。研究发现该基因在核盘菌中沉默可以提高其对盾壳霉的抵抗能力,沉默转化子菌核显著诱导盾壳霉分生孢子的萌发;然而因沉默转化子被盾壳霉寄生能力的下降,盾壳霉在核盘菌菌丝上分生孢子的产生数目显著降低。由此可知,盾壳霉抑制核盘菌中莽草酸合成基因表达以及诱导核盘菌Ss NEP2基因表达,可能都是盾壳霉重寄生作用的一个影响因素。推测莽草酸和Ss NEP2影响盾壳霉重寄生核盘菌过程。总之,盾壳霉寄生核盘菌的过程是一个复杂的、涉及到盾壳霉或核盘菌中多个生物学过程以及基因变化的双向调控过程。本研究对盾壳霉全基因组测序及分析,结果为进一步研究盾壳霉生长、发育、寄生等生物学特性等提供了平台,同时为从盾壳霉中挖掘相关的基因资源和次生代谢产物资源奠定了基础。