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第一部分:重组腺病毒BMP9及DKK1的扩增及有效转染小鼠骨髓间充质干细胞目的:通过HEK293细胞对已经构建好的带有目的基因的重组腺病毒BMP9及DKK1进行扩增,以获得高滴度的重组腺病毒浓缩液。确认重组腺病毒是否有效感染间充质干细胞C3H10T1/2细胞及适宜的病毒感染剂量,并验证目的基因是否在干细胞中有效表达。方法:通过乒乓交互感染获取高滴度Ad-BMP9及Ad-DKK1重组腺病毒浓缩液。PCR及Western blot检测腺病毒感染干细胞后后目的基因的RNA及蛋白水平的表达情况。结果:通过HEK293细胞扩增获得高滴度的重组腺病毒浓缩液,且有效感染小鼠间充质干细胞C3H10T1/2细胞。在倒置荧光显微镜观察到绿色荧光蛋白的表达,取50%的重组腺病毒感染干细胞的剂量为适宜的实验剂量。并通过PCR及Western blot法验证到目的基因在C3H10T1/2细胞中有效进行转录和翻译,最终确认了Ad-BMP9及Ad-DKK1病毒的有效性。结论:重组腺病毒原液可通过HEK293进行扩增以获得高滴度的病毒浓缩液。且Ad-BMP9及Ad-DKK1病毒能有效转染C3H10T1/2细胞,上调目的基因的表达,为后续研究DKK1过表达对BMP9诱导间充质干细胞C3H10T1/2细胞成骨分化的影响及机制奠定了基础。第二部分:DKK1对BMP9诱导间充质干细胞成骨分化的影响的体内外研究目的:研究Wnt信号的抑制剂DKK1对BMP9诱导间充质干细胞成骨分化的影响。方法:运用重组腺病毒Ad-BMP9及Ad-DKK1转染C3H10T1/2细胞,在体外通过化学方法检测碱性磷酸酶表达情况;利用RT-PCR和Western Blot检测骨桥蛋白和骨钙蛋白转录及翻译的水平;钙盐沉积的变化则通过茜素红S染色分析。同时,通过干细胞异位成骨,在体内验证DKK1对BMP9诱导间充质干细胞骨向分化的影响。并通过q PCR分析BMP9对DKK1表达的影响。结果:DKK1不仅可以在体外明显的抑制BMP9诱导的间充质干细胞的ALP活性,而且同时可以促进骨桥蛋白和骨钙蛋白的转录和翻译,且能够促进晚期的钙盐沉积。在干细胞移植实验中,DKK1同样能够抑制BMP9诱导的间充质干细胞的骨向分化及骨块的成熟。同时,BMP9可以增加DKK1的表达,并呈剂量相关。BMP9对DKK1表达的上调可以被MAPK-P38抑制剂SB203580所阻断,而不能被MAPK-ERK抑制剂PD98059所干扰。结论:Wnt信号抑制剂DKK1可以同时在体内外抑制BMP9诱导的间充质干细胞成骨分化。同时BMP9可能是部分通过MAPK-P38途径上调DKK1的表达。因此DKK1可能是通过负反馈抑制BMP9诱导的成骨分化。第三部分探讨DKK1抑制BMP9诱导成骨分化机制及经典的Wnt/β-catenin所起的作用目的:探讨DKK1抑制BMP9诱导间充质干细胞成骨分化的可能机制及经典的Wnt/β-catenin在其中所起的作用。方法:运用重组腺病毒Ad-β-catenin、Ad-BMP9及Ad-DKK1转染C3H10T1/2细胞,在体外通过化学方法检测碱性磷酸酶表达情况,钙盐沉积的变化则通过茜素红S染色分析。同时,通过BMPs-Smad报告质粒检测Smad的转录水平,并通过Western blot检测Smad的蛋白水平的表达。通过q PCR和Western blot检测成骨因子Runx2的表达。联用Ad-β-catenin,检测ALP、Smad及钙盐沉积的情况来验证DKK1抑制BMP9诱导的间充质干细胞成骨分化是否通过经典的Wnt/β-catenin通路实现的。结果:DKK1能够显著地抑制BMP诱导的Smad转录活性及磷酸化;并可能通过BMP-Smad途径抑制成骨关键因子Runx2的表达。同时,DKK1可以抑制BMP9的诱导经典的Wnt/β-catenin信号表达,而且直接干扰β-catenin的表达同样可以达到抑制BMP9诱导的间充质干细胞成骨分化的作用。通过腺病毒过表达β-catenin可以挽回DKK1对BMP9诱导间充质干细胞骨向分化的抑制作用。结论:DKK1能够通过抑制BMP-Smad-Runx2轴抑制成骨分化。经典Wnt/β-catenin和BMP9在诱导成骨分化存在协调作用,DKK1通过经典的Wnt/β-catenin途径抑制BMP9诱导间充质干细胞成骨分化。