【摘 要】
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目前,我国主要应用全病毒灭活疫苗预防控制口蹄疫,但该疫苗制造过程复杂、存在生产过程活病毒逃逸和疫苗中病毒灭活不彻底引起疫情的风险,同时还具有免疫持续期短、副作用大
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目前,我国主要应用全病毒灭活疫苗预防控制口蹄疫,但该疫苗制造过程复杂、存在生产过程活病毒逃逸和疫苗中病毒灭活不彻底引起疫情的风险,同时还具有免疫持续期短、副作用大等缺点,并未能满足畜牧业健康稳定发展的需要。而基因工程疫苗有望克服以上不足,特别是基因缺失活病毒疫苗,有望获得更加安全、有效且更长的免疫持续期。为达此目的,以口蹄疫弱毒疫苗曾经使用的鸡胚(chick embryo,CE)传代致弱的口蹄疫病毒O/Akesu/58 CE39毒株为研究对象,经过BHK-21细胞的适应性传代,以间接免疫荧光试验检测此毒株的病变特点,挑选蚀斑,从而得到了蚀斑克隆株O/Akesu/58 CE39A,以O型FMDV全基因组序列(Gen Bank登录号:AJ539138)为参考序列,将基因组全长分为七个相互重叠的片段设计引物,用5’RACE法扩增5’端序列,用常规PCR法扩增其余片段,再将各目的片段克隆至p MD19-T vector进行序列测定,剔除冗余序列,拼接得到O/Akesu/58 CE39A全基因组的真实序列。测序结果表明,病毒基因组全长8223 nt,其中5’NCR长约1101 nt,前导蛋白L编码区长603 nt,3’NCR为98 nt,3’末端为25 nt的Poly(A)尾。编码区核苷酸全长6999 nt,编码2333个氨基酸残基的多聚蛋白。序列分析表明,该毒株属于Cathy拓扑型。同时,探索了以常规PCR法成功扩增FMDV 5’端序列的最优条件。本试验共进行了72次PCR,成功率为6/72,说明FMDV 5’端序列的扩增难度大,应合理设计反转录引物和扩增引物。将O/Akesu/58 CE39A全基因组真实序列分成六个片段扩增、酶切、克隆至p UC57vector,顺次拼接为全长c DNA感染性克隆。将已构建的FMDV基因组全长质粒p UC57-O/Akesu/58 CE39A用Eco RV进行酶切,出现预期大小11041 bp的一条带;再用Sal I进行酶切,出现预期大小2761 bp和8269 bp的两条带。酶切鉴定结果表明,FMDV基因组全长质粒构建成功,为病毒的拯救奠定了基础,同时为许多RNA病毒反向遗传学研究提供了参考。
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