毛竹KdsD蛋白的原核表达纯化及酶学性质研究

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毛竹属于禾本科竹亚科单子叶植物,其细胞壁主要成分由纤维素和果胶组成。植物果胶中的2-酮-3-脱氧辛糖酸(KDO)是非常保守的八碳糖,主要通过KDO合成途径合成。该途径中阿拉伯糖-5-磷酸异构酶(Arabinose-5-phosphate isomerase,KdsD)[EC:5.3.1.13]是KOD合成途径的第一个关键的限速酶。但禾本科毛竹中KdsD的结构和生物学功能尚不清楚。本研究以毛竹为研究对象,进行了初步研究,结论如下;1.成功构建得到毛竹KdsD蛋白的原核表达载体,经过诱导、表达,成功获得了大量重组蛋白的可溶性表达。2.表达产物经Ni-NTA亲和层析和分子筛层析(SEC)方法进行酶蛋白的分离纯化步骤,得到纯度85%以上的高纯度酶;分子筛层析和BN-PAGE结果发现纯化后的目的蛋白KdsD在溶液中主要以多聚体、二聚体和单体形式存在,这同微生物来源KdsD酶在溶液中以四聚体形式存在很大差异;进一步使用Western blotting和MALDI-TOF MASS技术对纯化的蛋白进行鉴定。3.测定了毛竹KdsD酶学性质,证明该酶催化反应的最适pH值为8.5,最适作用温度为37℃,各种金属离子在低浓度均对酶活性存在不同程度的影响作用,金属离子Zn2+,Ca2+,Mg2+,Co2+对酶活性有激活作用,K+,Mn2+,Fe2+,Cd2+对酶活性有抑制作用,其中以Fe2+和Cd2+对酶活性的抑制作用最强,而金属离子Cu2+,Se2+,Li+,Na+对酶活性无明显的影响。4.毛竹KdsD酶动力学常数Vmax和Km值分别为0.20 mmol/L·min,0.14mmol/L,比较发现该酶与底物的亲和性高于大肠杆菌KdsD。5.毛竹不同组织实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)结果表明:PeKdsD基因在叶中表达量远远高于其他组织。
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