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乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,据资料统计,发病率占全身各种恶性肿瘤的7~10%,在西方国家其发病率及死亡率均居女性恶性肿瘤之首。我国女性乳腺癌的发病率逐年上升,而且发病年龄有年轻化的趋势,乳腺癌已成为对妇女健康的最大威胁。乳腺癌治疗主要以手术、化疗、放疗及内分泌治疗为主,随着治疗技术的不断提高,其生存率有了很大的改善,病死率显著下降。但肿瘤细胞侵袭和转移仍是导致许多病人死亡的原因之一,也是影响肿瘤预后主要指标和指导治疗的重要依据。许多学者致力于肿瘤侵袭、转移的分子学研究,以期能发现更精确可靠的生物学标志物。肿瘤细胞在整合蛋白介导下与细胞外基质(ECM)粘附是肿瘤细胞侵袭、转移的重要原因之一,在整合蛋白介导的信号转导中粘着斑激酶起关键作用。粘着斑激酶(Focal adhesion kinase, FAK)是一种非受体酪氨酸激酶,它在细胞间及细胞与细胞外基质粘附中起关键作用。研究证明,FAK在乳腺癌、直肠癌、甲状腺癌、肝癌、前列腺癌中表达量增高,且与肿瘤侵袭及转移密切相关。本课题以女性常见恶性肿瘤乳腺癌为研究对象,研究利用RANi干扰FAK表达及对乳腺癌细胞生物学行为的影响。目的:应用RNA干扰技术,构建针对人粘着斑激酶FAK的siRNA表达载体,研究RNA干扰FAK的表达及对人类乳腺癌MCF-7细胞生物学特性的影响。方法:根据GenBank数据库提供的FAK基因序列(GI:439874)构建表达FAK基因siRNA的重组质粒FAK-pGenesil-siRNA,并随机设计一条阴性对照FAK-pGenesil-HK。测序鉴定后,在脂质体的介导下转染入人乳腺癌MCF-7细胞,优化转染条件,荧光倒置显微镜下观察转染效率,应用RT-PCR和Western blot检测FAK mRNA和蛋白表达,流式细胞术分析细胞周期分布,体外实验测定肿瘤细胞穿透matrigel的能力。结果:(1)经过优化细胞转染条件,当所构建的重组质粒与脂质体的质量体积比为1:4(μg/μl)转染时,转染效率较高,可达60%以上。(2)RT-PCR及Western blot结果:转染重组质粒FAK-pGenesil- siRNA后能使乳腺癌MCF-7细胞株FAK mRNA及蛋白的表达下调。干扰组FAK mRNA抑制率为61.80%,与阴性对照组0.31%比较,差异有统计学意义(p<0.05);干扰组FAK蛋白抑制率为46.55%,与阴性对照组8.62%比较,差异有统计学意义(p<0.05)。(3)流式细胞仪测定细胞周期结果:重组质粒转染48小时后,转染了重组质粒FAK-pGenesil-siRNA的干扰组MCF-7细胞增殖指数为25.89±0.26% ,阴性对照组和空白对照组分别为37.96±0.60%、38.21±0.56%。与干扰组相比较,差别有统计学意义(p<0.05);与干扰组相比,阴性对照组和空白对照组有更多的细胞被阻滞于G0-G1期。体外侵袭实验结果:重组质粒转染48小时后,转染了重组质粒FAK-pGenesil-siRNA的干扰组MCF-7细胞穿过Matrigel膜的个数为30.33±1.53,阴性对照组和空白对照组分别为37.96±0.60、38.21±0.56。与干扰组比较,差别有统计学意义(p<0.01)。结论:重组质粒FAK-pGenesil-siRNA被成功构建,并能有效抑制人乳腺癌MCF-7细胞FAK基因mRNA和蛋白的表达,降低细胞增殖能力及侵袭力,为后续研究以及乳腺癌的基因治疗奠定了基础。