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布鲁菌病(Brucellosis)是由布鲁菌(Brucella)感染引发的一种人畜共患传染性疾病。布鲁菌为革兰染色阴性的兼性胞内寄生菌,巨噬细胞是其生存和繁殖的靶细胞,它主要通过抑制细胞凋亡、促进细胞自噬得以在宿主细胞内长期生存繁殖。已有研究表明AMPK/p70s6k信号通路不仅参与细胞凋亡、自噬等多种细胞活动,还与病原体在细胞内的生存繁殖密切相关。目的:本研究拟通过建立羊种布鲁菌16M(16M)体外感染小鼠巨噬细胞RAW264.7(RAW264.7)实验模型,探讨AMPK/p70s6k信号通路对布鲁菌胞内生存繁殖以及布鲁菌介导细胞自噬的影响,从而揭示布鲁菌在宿主细胞内的持续感染与AMPK/p70s6k信号通路密切相关。方法:1.建立16M体外感染RAW264.7细胞的实验模型,应用Western blot技术检测不同时间段RAW264.7细胞内p-AMPK(Thr172)和p-p70s6k(Thr389)的表达量变化。2.AMPK抑制剂Compound C(CC)与RAW264.7细胞共同孵育1h,然后,用16M侵染RAW264.7细胞,未经Compound C处理的细胞作为对照组,感染4h、8h、12h、24h和48h后通过布鲁菌的CFU计数检测布鲁菌胞内存活情况;Western blot技术检测AMPK抑制剂Compound C对16M介导RAW264.7细胞内p-AMPK(Thr172)和p-p70s6k(Thr389)表达的抑制效果。3.抑制剂Compound C与RAW264.7细胞共同孵育1h,然后,用16M侵染RAW264.7细胞,未经抑制剂Compound C处理的细胞作为对照组,利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)和Western blot检测自噬相关基因LC3-II/LC3-I转换率、Beclin1和ULK1的表达。4.采用小分子干扰RNA(si RNA)软件设计3对针对AMPKα2基因不同位点的si RNA片段,由公司合成此si RNA片段,将特异性si RNA经转染试剂si RNA-mate介导转染至RAW264.7细胞内,24h后收集细胞,分别采用q RT-PCR和Western blot技术检测AMPKα2的m RNA和蛋白表达情况,分析对应不同位点的三对特异性si RNA片段对AMPKα2的沉默效果,筛选出实验所需干扰效果最好的AMPKα2-si RNA片段。5.将干扰效果最好的si RNA片段转染至RAW264.7细胞内,6h后用16M侵染RAW264.7细胞,未转染AMPKα2-si RNA片段的细胞和转染阴性对照片段(NC)的细胞作为对照组,利用CFU计数法检测16M在RAW264.7细胞内的生存繁殖能力;利用q RT-PCR和Western blot技术分别检测自噬相关基因Beclin1和ULK1的m RNA和蛋白表达水平。结果:1.16M侵染RAW264.7细胞后,p-AMPK(Thr172)在第2h表达量最高(P<0.05),在第8h、12h和24h其表达水平恢复正常,与对照组相比无显著差异(P>0.05),p-p70s6k(Thr389)的表达量在各时间点均低于对照组(P<0.05),自噬相关蛋白Beclin1和ULK1的表达显著高于对照组(P<0.05)。2.在4h、8h、12h、24h和48h,经抑制剂Compound C处理过的RAW264.7细胞内16M数目显著低于对照组细胞(P<0.05)。3.在12h和24h,16M+CC组细胞中的p-AMPK(Thr172)、LC3-II/LC3-I转换率、Beclin1和ULK1的蛋白水平显著低于16M组细胞(P<0.01),p-p70s6k(Thr389)的蛋白表达高于16M组细胞(P<0.01),16M+CC组细胞中Beclin1和ULK1的m RNA相对表达量显著低于16M组细胞(P<0.01)。4.与正常组、si RNA-mate组和NC组相比,构建的特异性si RNA片段能有效降低RAW264.7细胞内AMPK的m RNA和蛋白表达水平,差异具有统计学意义(P<0.05)。对应不同位点的三对si RNA片段,其中AMPKα2-865-si RNA对AMPK m RNA和蛋白表达量的抑制效果最强。5.分别在12h和24h,沉默AMPKα2基因细胞组内16M数目显著低于空白对照组和NC细胞组(P<0.01);沉默AMPKα2基因后,分别在12h和24h细胞内的p-AMPK(Thr172)、LC3-II/LC3-I的转换率、Beclin1和ULK1的蛋白水平显著低于16M组细胞(P<0.01),p-p70s6k(Thr389)的蛋白表达高于16M组细胞(P<0.01),Beclin1和ULK1的m RNA相对表达量显著低于16M组细胞(P<0.01)。结论:1.布鲁菌16M可以激活RAW264.7细胞内的AMPK/p70s6k信号通路。2.抑制剂Compound C可显著降低16M在RAW264.7细胞内的存活。3.抑制剂Compound C可显著抑制16M介导的RAW264.7细胞自噬。4.沉默AMPKα2基因后,可降低16M在RAW264.7细胞内的存活,降低16M介导的RAW264.7细胞自噬。