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Sec分泌系统又称Sec途径或者一般分泌途径,是一类发现的比较早的分泌蛋白的机器,位于革兰氏阴性细菌的内膜上。通过sec分泌途径分泌的蛋白均带有一段信号肽序列,可被特异的受体识别,并与之结合进而引导蛋白的跨膜转运。Sec转运酶是一个多组分的蛋白质复合体,膜蛋白三聚体SecYEG及水解ATP的动力蛋白secA构成了Sec转运酶的核心。整合膜蛋白SecD,SecF和YajC形成了一个复合体亚单位,可与SecYEG相连并稳定secA蛋白的膜结合形式。磷脂酰胆碱(PC)是细胞膜上的一种重要的结构组成成分。广泛的存在于包括动物,植物和人类等的真核生物中,还有一小部分的原核生物中也含有PC。丁香假单胞杆菌丁香致病变种1336(Pseudomonas syringae pv. syringae)和土壤假单胞杆菌593(Pseudomonas sp.593)能够通过磷酰胆碱合酶(Pcs)途径合成磷脂酰胆碱。丁香假单胞杆菌丁香致病变种1336(Pseudomonas syringae pv. syringae)和土壤假单胞杆菌593(Pseudomonas sp.593)能够通过内膜上的Sec途径分泌β-内酰胺酶。本实验通过研究比较Pseudomonas syringae pv. syringae1336和Pseudomonas. sp593的野生型菌株与磷脂酰胆碱合酶基因(pcs)突变体的p-内酰胺酶分泌情况,及酶活测定,蛋白免疫印迹(Western-blotting), RT-PCR等技术分析细胞膜上PC对Sec系统分泌功能的影响。主要包括以下几个方面的研究工作。(1) Pseudomonas syringae pv. Syringae1336和Pseudomonas sp.593的野生型和突变体菌株对氨苄青霉素Amp抗性的检测。首先通过滤纸平板法初步检测以上四种菌对Amp的抗性。结果发现,1336和其pcs突变体1336pcs-,593和其pcs突变体593pcs-对Amp的抗性都是不同的。然后测定了Amp对以上四种菌的半致死剂量(IC50)。(2)p-内酰胺酶的活性测定。提取1336、1336pcs-和593、593pcs-中的周质和胞质蛋白,以头孢硝噻吩为底物,用分光光度计时间扫描测定p-内酰胺酶的活性,发现1336和593野生型和其相应的突变体中β-内酰胺酶活性的存在明显的差异。(3)1336、1336pcs-和593、593pcs-中β-内酰胺酶基因的克隆及表达。从NCBI网站中查询得到Pseudomonas syringae pv. SyringaeB728a中可能编码β-内酰胺酶的基因,共有六个,分别设计引物,以1336和593的总DNA为模板进行PCR。结果只有AmpC, psyr2741, psyr3855三个基因被克隆出来。将三种基因的PCR产物经过测序,SignalP信号肽预测等,发现AmpC基因所编吗的蛋白序列N端的1-21个氨基酸残基为信号肽。通过蛋白信号肽的特征比较分析,可确定此信号肽是依赖Sec分泌系统的特异性信号肽,即带有此信号肽的蛋白前体可通过Sec系统分泌。而psyr2741, psyr3855却没有此特异的信号肽序列。(4)多克隆抗体的制备和Western-blotting检测。将AmpC, psyr2741, psyr3855三个基因分别连接表达载体PET23a载体并转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达和相应蛋白的纯化。纯化的蛋白,在兔子皮下注射,取血清得到多克隆抗。通过Western-blotting检测1336和593野生型和突变体胞质和周质中AmpC, Psyr2741, Psyr3855的量。结果发现突变体菌株中其周质中AmpC的量比野生型菌株周质中的含量多,胞质中无明显的差异。而蛋白Psyr2741, Psyr3855只在胞质中检测到少量的表达,周质中却未检测到。(5) AmpC、Psyr2741、Psyr3855包涵体的复性及活性的检测。收集在BL21(DE3)中表达的以上三种蛋白的包涵体,经过纯化后,在相应的包涵体复性液中通过梯度透析法复性36个小时。收集复性后的蛋白上清液,用抗生素头孢硝噻吩测定是否有β-内酰胺酶的活性。结果发现复性后的蛋白液只有AmpC有β-内酰胺酶的活性。(6)反转录PCR(RT-PCR)检测AmpC, Psyr2741, Psyr3855在1336和593及相应突变体中的表达。提取1336、1336pcs-和593、593pcs-中总的RNA,反转录合成cDNA,以16sRNA为内参,通过PCR检测AmpC、psyr2741、psyr3855三个基因在1336和593及其相应的突变体中的表达情况,发现三种蛋白在1336、1336pcs-和593、593pcs-四种菌株中均有表达,且其表达量在野生型和突变体菌株中均无明显的差异。通过以上研究,可得出以下结论：首先从1336和593中克隆出的AmpC, Psyr2741, Psyr3855三个基因只有AmpC是编码β-内酰胺酶的基因,且造成1336和593突变体的抗Amp能力较野生型高的主要原因是AmpC蛋白在突变体的菌株中被分泌至周质空间的量较多。其次,通过实验发现造成野生型和突变体分泌至周质空间的AmpC蛋白的量不同的主要原因是由PC引起的。即PC影响了1336、1336pcs-和593、593pcs-中β-内酰胺酶通过Sec系统的分泌。