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血友病是一种由于凝血因子FVIII或FIX缺乏引起的先天性出血性疾病[1]。研究表明,合并抗凝蛋白缺陷的血友病患者表现出较轻的出血症状[41-42]。本研究的目的是寻找一种新的血友病治疗方式,即通过RNA干扰方式靶向一种可灭活凝血酶的重要抗凝蛋白,肝素辅因子II（HCII）。筛选出的小干扰RNA（siRNA）与N-乙酰半乳糖胺（Gal NAc）共价结合（Gal NAc-HCII）可促进药物靶向肝脏。野生小鼠给予一次Gal NAc-HCII后,表现出有效的、持续的和剂量依赖性的HCII抑制作用。给药7天后,2、5和10mg/kg剂量的Gal NAc-HCII可使HCII水平分别降低至25.04±2.56%、11.65±2.41%和6.50±1.73%。Gal NAc-HCII治疗组的血友病小鼠止血能力可明显提高且呈剂量依赖性,包括缩短的颈动脉血栓形成时间及减少的尾动脉出血时间。10mg/kg剂量的Gal NAc-HCII可使小鼠止血能力恢复至正常水平。虽然与野生小鼠仍有差别,但是Gal NAc-HCII可明显降低血友病小鼠活化部分凝血活酶时间（APTT）,且缩短APTT的持续时间比重组FVIII（rh FVIII）替代治疗组更久。此外,30mg/kg的剂量不会增加血友病小鼠潜在的血栓风险,也未发现病理性血栓形成,即使合并rh FVIII治疗。因此,本研究证实Gal NAc-HCII治疗血友病小鼠是相对安全有效的,可作为血友病患者一种新的选择。第一部分体外HCII中和对凝血酶生成的影响目的:观察体外HCII抑制对血浆凝血酶生成的影响。方法:特异性HCII中和抗体中和FVIII缺陷血浆中的HCII活性;发色底物法检测HCII活性水平;通过凝血酶生成实验评估HCII抑制血浆中凝血酶生成水平。结果:当血浆与中和抗体的比例为9:1时可显著降低HCII的活性到9.7±0.8%;在没有DS时,HCII抑制对FVIII缺陷血浆凝血酶生成影响不大,而DS存在时,HCII抑制可促进血浆凝血酶生成;在HCII抑制的条件下额外补充1IU/ml rh FVIII可显著提高血浆凝血酶生成水平但不会超过正常对照血浆。结论:在DS存在的情况下,HCII抑制可明显促进血友病血浆凝血酶生成,即使额外补充rh FVIII,也不会过度激活凝血导致潜在的血栓形成风险。第二部分靶向肝脏HCII基因的siRNA筛选目的:于肝细胞水平筛选出可特异性敲低人和小鼠HCII蛋白的siRNA。方法:设计针对人和小鼠HCII m RNA共同序列的siRNA,利用lipofectamine3000对小鼠肝细胞系（Hepa1-6）和人肝细胞系（Hepg2）进行siRNA转染;Trizol法提取细胞总m RNA,利用实时荧光定量q RT-PCR检测HCII相对于管家基因GAPDH的m RNA丰度;RIPA裂解细胞提取总蛋白,利用Western blot测定HCII蛋白相对于内参GAPDH的水平。结果:最佳siRNA（siRNA-HCII,5′-UGGUGGAGAGAUGGCAAAAAA-3′）被筛选出来。在小鼠（Hepa1-6）或人（Hep G2）肝细胞中,siRNA-HCII处理组的HCII m RNA水平显著降低,与siRNA阴性对照组（siRNA-control）相比分别降低到6.65±1.61%和6.17±4.50%;在Hepa1-6和Hep G2细胞系中,siRNA-HCII处理组的HCII蛋白水平分别降低到10.06±6.89%和13.38±9.04%。结论:siRNA-HCII可有效降低小鼠及人肝细胞HCII表达。第三部分siRNA药物在小鼠体内的药代药效反应目的:观察siRNA-HCII在小鼠体内的药代及药效反应。方法:siRNA-HCII与N-乙酰半乳糖胺（Gal NAc）共价结合形成Gal NAc-HCII;C57BL/6小鼠皮下注射经CY3染料标记的Gal NAc-HCII（Gal NAc-HCII-CY3）,通过荧光显微镜观察组织冰冻切片荧光;C57BL/6小鼠皮下注射2,5或10mg/kg Gal NAc-HCII,利用茎环法q RT-PCR检测不同时间点血浆及肝脏中的药物水平;C57BL/6小鼠单次及多次皮下注射不同剂量Gal NAc-HCII,利用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测不同时间点血浆HCII抗原水平。结果:Gal NAc-HCII-CY3在肝脏切片中的荧光强度明显高于其他组织,且于给药后4h达到最大荧光强度;Gal NAc-HCII药物水平呈剂量及时间依赖性,且分别于给药后30min及4h达到血浆及肝脏最大浓度;Gal NAc-HCII对HCII蛋白水平呈剂量依赖性抑制,单次注射后第7天HCII水平达到最低值,多次给药2周后HCII蛋白可维持低水平（~20%）较长时间。该药物特异性地靶向肝脏并在给药后4小时出现最大荧光强度,而其他器官未观察到药物积聚;Gal NAc-HCII的药物水平主要取决于给药剂量和时间点,在给药后30min和4h,血浆和肝脏中的药物浓度分别达到峰值;Gal NAc-HCII治疗小鼠的HCII蛋白水平呈剂量依赖性抑制,单次给药后7d HCII蛋白出现最低水平,且重复给药2周后,HCII蛋白降至稳定水平（~20%）。结论:Gal NAc-HCII具有显著的肝脏靶向性,在小鼠体内可维持较长时间且能有效抑制血浆及肝脏HCII蛋白水平。第四部分体内HCII抑制对小鼠止血能力的改变目的:观察Gal NAc-HCII对血友病小鼠止血能力的影响。方法:血友病小鼠单次皮下注射2,5或10mg/kg Gal NAc-HCII,利用Fe Cl3诱导的颈动脉急性损伤模型评估小鼠血栓形成时间;利用尾动脉截断模型评估小鼠出血时间;单次注射后于不同时间点取血检测活化部分凝血活酶（APTT）;多次皮下注射不同剂量Gal NAc-HCII后取血检测APTT评估多次给药效应。结果:Gal NAc-HCII明显缩短小鼠颈动脉血栓形成时间及尾动脉出血时间,呈剂量依赖性,且10mg/kg的剂量可使小鼠止血能力恢复至正常水平;Gal NAc-HCII可明显降低APTT,但仍与正常水平有差异,即使是多次给药;与rh FVIII组相比,Gal NAc-HCII处理组APTT维持时间更久。结论:Gal NAc-HCII可明显改善血友病小鼠的止血能力,尤其对于创伤性出血效果更为显著。第五部分靶向HCII的siRNA药物毒副作用的研究目的:研究Gal NAc-HCII对血友病小鼠的毒副作用。方法:血友病小鼠皮下注射30mg/kg Gal NAc-HCII,每2天一次共注射6次;观察小鼠给药期间体重、饮食、四肢活动、存活情况等临床表现;收集小鼠血浆检测APTT、血常规、肝肾功能、心肌酶及凝血酶生成;收集小鼠组织器官,评估大小、形状及颜色;获取小鼠HE染色组织切片评估Gal NAc-HCII的细胞毒性。结果:小鼠对Gal NAc-HCII良好耐受,饮食活动等未见明显异常;肝功能指标轻度升高,组织切片显示局部肝细胞点状坏死;组织器官大小形状颜色正常,未见明显的病理性血栓形成;Gal NAc-HCII促进血浆凝血酶生成,明显降低APTT,但均未超过正常小鼠水平,即使合并rh FVIII替代治疗。结论:Gal NAc-HCII具有一定的肝毒性,但不会增加血友病小鼠潜在的血栓风险。