脉心康干预载脂蛋白E基因敲除小鼠动脉粥样硬化及其巨噬细胞泡沫化的分子机制研究

来源 :山东中医药大学 | 被引量 : 4次 | 上传用户:chshlu
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目的:1.探讨动脉粥样硬化(As)中医病因病机治则新认识,分析整理脉心康胶囊创制的理论基础及前期成果。2.通过载脂蛋白E基因敲除[ApoE(-/-)]小鼠整体体内实验及其腹腔巨噬细胞体外细胞培养实验,多层次、多靶点探讨脉心康抗As的作用原理特别是分子机制。方法:1.结合中医药文献、基础理论和临床实际,在对As中医病因病机治则传统认识回顾的基础上,进行创新性探讨;对脉心康的方药组成特色进行中西医结合分析,对脉心康的临床应用与基础研究成果进行分析整理。2.实验研究:(1)整体体内实验研究:ApoE(-/-)小鼠按随机数字表法随机分组,各组分别给予脉心康、洛伐他汀、罗格列酮、生理盐水灌胃,正常对照组(正常C57BL/6J小鼠)给予生理盐水灌胃,各组与正常对照组分别于给药后第8周、第12周各处死一半,静脉取血,取主动脉标本固定、染色及相应处理。(2)细胞学实验研究:ApoE(-/-)小鼠腹腔巨噬细胞培养,各组分别给予脉心康、洛伐他汀、罗格列酮无菌含药血清,并与ox-LDL共孵育(泡沫化),分别观察0—72小时不同时相的指标变化。光镜及电镜下观察主动脉As病变及超微结构;激光共聚焦扫描显微镜检测细胞内钙离子(Ca2+);高效液相色谱法检测细胞内胆固醇及胆固醇酯;免疫组化法检测细胞、主动脉PPARγ、ABCA1、CD36蛋白表达;流式细胞仪检测CD36;原位杂交法检测细胞、主动脉PPARγ、CD36、ABCA1 mRNA表达;ELISA法检测血清、巨噬细胞培养液TNF-α、IL-1β。结果:1.明确了As及其易损斑块的气虚血瘀,毒损脉络病机和益气活血解毒治则创新思路,体现此治则的脉心康对As与高脂血症疗效显著,具有降脂、抗炎、抗氧化、保护血管内皮、抗As、抑制细胞外基质降解、稳定斑块等作用。2.实验研究:(1)整体体内实验研究:脉心康能使ApoE(-/-)小鼠As病理形态学及超微结构改变减轻,有助于斑块缩小稳定;脉心康组、罗格列酮组血管壁PPARγ、ABCA1 mRNA的表达显著增加,PPARγ、ABCA1蛋白的表达显著增加;脉心康组、洛伐他汀组血管壁CD36 mRNA表达及CD36蛋白的表达显著降低;脉心康组、洛伐他汀组、罗格列酮组血清TNF-a、IL-1水平显著降低。(2)细胞学实验研究:用含药血清干预ApoE(-/-)小鼠泡沫化腹腔巨噬细胞后,巨噬细胞内Ca2+浓度各组都有升高,脉心康、洛伐他汀、罗格列酮含药血清干预组Ca2+浓度显著低于生理盐水组和空白对照组;脉心康、罗格列酮组PPARγ及ABCA1mRNA表达和PPARγ及ABCA1蛋白表达较洛伐他汀、空白对照组和生理盐水组均显著增加;脉心康、洛伐他汀组CD36 mRNA表达与CD36蛋白表达均显著低于罗格列酮组、生理盐水组和空白对照组。脉心康组、洛伐他汀组及罗格列酮组细胞内总胆固醇、游离胆固醇及胆固醇酯含量显著低于生理盐水组和空白对照组。脉心康组、洛伐他汀组及罗格列酮组培养液TNFα、IL-1β较生理盐水组和空白对照组显著降低。结论:1.益气解毒活血方脉心康具有确切的降脂、抗炎、抗As与稳定易损斑块等作用。2.脉心康通过增加PPARγ、ABCA1mRNA表达,增加PPARγ、ABCA1蛋白表达,降低CD36 mRNA表达和蛋白表达,减少巨噬细胞内胆固醇及胆固醇酯的含量,降低巨噬细胞钙超载,减少巨噬细胞释放TNFα、IL-1β,达到抗炎、降低巨噬细胞的趋化性、抗细胞泡沫化,从而保护动脉、保护超微结构、抗As及稳定斑块,对防治As和预防急性冠脉综合征等心脑血管事件有重要意义。
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