研究背景 越来越多的研究证明，实体恶性肿瘤内存在一小部分成瘤能力特别强，分化程度极低的细胞，称为“肿瘤启动细胞(tumor initiating cells)”，“成瘤性癌细胞(tumorigenic cells)”或“癌干细胞(cancer stem cells)”。癌干细胞具有类似于成体干细胞的特性：自我更新的能力、多向分化的潜能，以及强大的体内成瘤能力。尽管在癌组织中癌干细胞的数目极少，但是数目极少的癌干细胞在肿瘤的发生、发展和转移中却发挥了至关重要的作用，而且是肿瘤逃避常规治疗导致最终复发的罪魁祸首。因此，消灭癌干细胞才是肿瘤治疗的关键。 近年关于microRNA(miRNA)对基因表达调控的研究发现，这些微小分子RNA所调控的目标基因主要是与细胞分化、增殖、细胞周期和凋亡调控，以及机体发育相关的基因。多种miRNA分子通过沉默癌基因或者抑癌基因的表达，参与癌细胞重要细胞生物程序的调控。此外，miRNA还调控胚胎干细胞或成体干细胞的分化和发育。 虽然miRNA是调节基因表达的重要机制，但是这些非编码小分子RNA是否也影响着癌干细胞的命运目前还不清楚。 研究目标 1.建立富集乳腺癌干细胞的方法，解决癌干细胞研究中由于癌干细胞数量极少所致的瓶颈问题。 2.检测乳腺癌干细胞与非癌干细胞之间是否存在miRNA表达的变化，探讨miRNA是否调控着不同亚群的肿瘤细胞之间的演变转化，是否调控癌干细胞的“干性(stemness)”。 3.研制特异性靶向乳腺癌干细胞的载体，导入miRNA抑制乳腺癌干细胞自我增殖和体内成瘤，并逆转乳腺癌干细胞的化疗耐药性。探讨特异靶向乳腺癌干细胞的治疗方法。 研究方法 围绕上述目标，本研究采用以下研究方法：1.乳腺癌干细胞的富集和分离鉴定：将SKBR3细胞株种植于免疫缺陷的NOD/SCID鼠，形成的异种移植瘤体内连续传代，同时给予低剂量化疗压力富集乳腺癌干细胞。通过球囊形成能力评价癌干细胞的体外自我更新能力；通过免疫细胞化学及流式细胞分析的方法检测乳腺癌分化标志物CK14、CK18、MUC-1、α-SMA的表达，以评价癌干细胞的分化潜能：使用3H-胸腺嘧啶掺入法检测癌干细胞的增殖能力；使用连续异种移植瘤形成实验评价成瘤能力。另一方面，对于原代乳腺癌细胞，使用流式细胞分选仪分选出lin-CD44+CD24-的乳腺癌干细胞。2.乳腺癌干细胞miRNA表达与功能研究：乳腺癌干细胞和非癌干细胞之间miRNA表达的差异通过miRNA微阵列的方法来比较，使用qRT-PCR和Northern Blot来验证let-7等miRNA表达的差异；使用荧光素酶报告系统来评价let-7 miRNA的功能。用慢病毒载体转导let-7α或H-RAS shRNA或HMGA2 shRNA，或者使用寡核苷酸(ASO)阻断let-7的表达等方法来验证let-7功能和表达的意义，用qRT-PCR和western blot分别检测let-7的靶基因H-RAS和HMGA2的mRNA表达和蛋白表达。3.靶向乳腺癌干细胞导入miRNA的研究：使用hyluronin包被修饰的脂质体载体(HA-LIP)将let-7α或H-RAS siRNA或HMGA2 siRNA特异性导入CD44+的乳腺癌干细胞；使用流式细胞仪和荧光显微镜分析转染效率和分布。使用MTT、Annexin V/PI、Tunnel检测化疗敏感性；使用western blot检测ABCG2的表达，使用流式细胞仪检测侧群细胞(side population，SP)的比例。研究结果在原发性乳腺癌患者肿瘤组织中，与未化疗组相比，接受新辅助化疗的乳腺癌患者中含有较多的CD44+CD24-的具有自我更新能力的乳腺癌细胞；同一患者，化疗后比化疗前乳腺癌干细胞比例增加；复发的乳腺癌患者恶性胸水中富含有Lin+CD44+CD24-的乳腺癌干细胞。我们将SKBR3细胞株种植于免疫缺陷的NOD/SCID鼠，形成的异种移植瘤体内连续传代3次，同时给予低剂量化疗压力，所获得的第三代细胞(SK-3rd细胞)的球囊形成能力远远高于源细胞SKBR3，SK-3rd球囊细胞具有癌干细胞的表型，不表达上皮型和间叶型癌细胞的分化标志物，体内成瘤能力高于SKBR3细胞，并且更容易发生肺转移和肝转移。 MiRNA微阵列分析的结果显示SK-3rd球囊细胞中大部分miRNA的表达降低，其中let-7家族所有成员在癌干细胞中的表达均缺失。let-7 miRNA的靶基因H-RAS和HMGA2蛋白在SK-3rd球囊细胞中高表达，在分化的SK-3rd细胞或SKBR3中的表达明显下降。在临床标本中也可以得到类似的结果。使用慢病毒载体在乳腺癌于细胞中导入let-7α，或通过转染ASO降低分化的癌细胞中let-7的表达，我们发现let-7调节乳腺癌干细胞的“干性”——体外自我更新能力，多向分化潜能，连续体内成瘤能力和转移能力。沉默乳腺癌干细胞中RAS蛋白的表达可以导致其自我更新能力的丧失，但不影响多向分化的潜能；但是沉默HMGA2的表达可以导致多向分化，而不影响自我更新能力。 使用HA-LIP可以高效地将let-7α特异性导入CD44+的乳腺癌干细胞，并且可以将小分子RNA释放到胞浆中发挥生物学功能，降低乳腺癌干细胞的球囊形成率和体内成瘤能力及转移能力。HA-LIP载体将let-7α导入乳腺癌干细胞后可以抑制乳腺癌干细胞自我增殖和体内成瘤，并能逆转乳腺癌干细胞的化疗耐药性。 结论 1.低剂量化疗可以提高乳腺癌干细胞在肿瘤细胞群内的百分率，因此可以此富集乳腺癌干细胞。 2.成瘤性乳腺癌干细胞lef-7 miRNA的表达降低。Let-7 miRNA通过调控不同的靶基因调节乳腺癌干细胞的“干性”，包括自我更新能力和分化潜能和成瘤能力。 3.HA-LIP可以高效地将let-7α特异性导入CD44+的乳腺癌干细胞，抑制乳腺癌干细胞自我增殖和体内成瘤，并逆转其化疗耐药性。