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附植前胚胎经过合子基因组激活和谱系分化最终发育成为具有三种细胞谱系的晚期囊胚。胚胎干细胞(ESCs)来源于囊胚内细胞团,在细胞治疗、药物研发、基因编辑、动物育种等领域具有重要的应用价值。受实验技术和胚胎细胞数的限制,人们对大动物附植前胚胎的发育调控机制研究比较匮乏,这也正是在猪和牛等大动物上一直未能获得具有生殖系嵌合能力ESCs的原因之一。因此,揭示猪、牛与小鼠附植前胚胎发育调控机制的异同,不仅对人类相关疾病和发育模型的建立、大动物的育种和胚胎工程至关重要,也可以为获得大动物的具有生殖系嵌合能力的ESCs提供理论依据。本研究首先从单细胞水平上比较分析了小鼠、猪和牛附植前胚胎发育的异同,然后针对表达模式相似的Tdgf1在小鼠附植前胚胎谱系分化和小鼠ESCs多能性维持中的调控机制进行了深入研究。为了从单细胞水平上比较分析在小鼠、猪和牛附植前胚胎发育过程中基因表达模式的异同,本研究首先利用单细胞微流控芯片基因表达分析的方法,分别检测了可能参与附植前胚胎发育和干细胞多能性维持的96个基因在来源于小鼠、猪和牛从合子到晚期囊胚期附植前胚胎共1247个单细胞中的mRNA表达模式。所选择基因组合的表达模式均能够区分小鼠、猪和牛的附植前胚胎不同发育时期,而且鉴定到了分别在发育早期和晚期表达的基因。小鼠、猪和牛早期囊胚的基因表达模式均能够区分滋养层(TE)和内细胞团(ICM)两种细胞谱系。小鼠和牛晚期囊胚的基因表达模式能够区分TE、原始内胚层(PE)和上胚层(EPI)三种细胞谱系,但猪晚期囊胚的基因表达模式只能区分TE和ICM两种细胞谱系。牛和小鼠的谱系特异高表达基因均在桑椹胚卵裂球中高表达,但猪的谱系特异高表达基因在桑椹胚期低表达或不表达。Prdm14和Tdgf1均在小鼠和牛EPI细胞中高表达。以上结果表明,小鼠、猪和牛附植前胚胎发育具有相同和不同点。为了进一步探究在小鼠和牛EPI细胞中均高表达的Tdgf1基因功能,本研究在小鼠附植前胚胎和ESCs中进行了深入研究。4-细胞期添加外源TDGF1蛋白可以促进PE细胞谱系形成。利用siRNA胞质注射敲降Tdgf1,能够促进EPI并抑制PE细胞谱系的分化。胚胎转录组测序分析发现,敲降Tdgf1后,BMP信号通路的受体Bmpr2和MAPK信号通路激活基因表达下调,引起EPI细胞谱系标记基因表达升高,而PE细胞谱系特异基因表达下降。同时,抑制细胞周期G1/S期转变的基因表达升高,ATP合成和线粒体有氧呼吸电子传递链相关基因表达下调。利用shRNA敲降Tdgf1后,ESCs克隆形态由立体紧致变为扁平松散。细胞周期分析发现,G1期比例增加而G2期比例减少。同时,ESCs ATP产量减少,线粒体膜电位降低。质谱分析和Co-IP验证发现,TDGF1可以与线粒体柠檬酸转运蛋白SLC25A1及线粒体呼吸链复合体Ⅳ成员NDUFA4结合。以上结果表明,Tagf1影响小鼠附植前胚胎EPI和PE细胞谱系的分化,有利于维持ESCs克隆形态、细胞周期及线粒体功能。综上所述,本研究从单细胞水平比较分析了小鼠、猪和牛附植前胚胎发育过程中基因表达模式的异同,并进一步探究了 EPI细胞高表达基因Tdgf1在小鼠附植前胚胎谱系分化和ESCs多能性维持中的调控机制。本研究丰富了猪和牛附植前胚胎发育调控机制的研究,拓宽了对Tdgf1功能的认识,为获得大动物ESCs提供了理论依据。