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自2007年本实验室对缙云山土壤拮抗放线菌资源进行调查研究,筛选获得一株拮抗效果显著的放线菌株JY-22,鉴定为链霉菌属吸水链霉菌Streptomyces hygroscopicus。实验室前期工作优化了该菌发酵条件,并明确JY-22菌株的发酵液对温度与紫外具有很好的稳定性,在80℃水浴3h后,紫外照射30 min后均不会对菌株JY-22发酵滤液抑菌活性造成影响。对真菌病原菌抑菌谱广,抑菌率达41.9%~75.7%。因此,有必要进一步研究JY-22抑菌机理和代谢活性产物特性,本文以烟草赤星病菌(Alternaria alternata)为靶菌,初步明确放线菌JY-22的活性代谢产物抑菌机理及其活性产物的分离纯化工艺为进一步研究提供依据。结论如下:1.JY-22对烟草赤星病的作用机理为明确吸水链霉菌JY-22的活性产物对烟草赤星病菌的抑菌机理,为后续产品开发应用提供依据。将10块培养4 d的烟草赤星病菌菌饼加入100 m L PD培养基中,摇床培养36 h后加入无菌发酵滤液,使其浓度分别为10%、5%、2.5%、1%、0%,24 h后采用电导率法测对细胞膜渗透性影响,96 h后采用菌丝湿重法和紫外吸收法测对菌丝生长,可溶性蛋白,麦角甾醇及丙二醛含量的影响。结果表明,JY-22对烟草赤星病菌具有拮抗作用,菌丝尖端出现膨大畸形、菌丝内原生质体外渗、细胞质凝聚出现囊状膨大物;JY-22无菌发酵滤液处理后,10%无菌滤液对菌丝抑制率达到75%,电导率增大电解质外漏,丙二醛含量显著升高,麦角甾醇与可溶性蛋白含量降低。表明放线菌JY-22对烟草赤星病菌具有显著拮抗作用,主要通过抑制麦角甾醇合成,引发细胞膜脂质过氧化,使细胞膜受损,导致菌丝生长受损。细胞膜是JY-22主要作用方式之一。2.JY-22活性物质的分离通过Doskochulova纸层析、Betina溶剂系统纸层析及pH纸层析初步确定JY-22的活性类型,通过对JY-22无菌发酵滤液的处理和分离纯化确定JY-22活性物质的分离方法。结果表明,JY-22活性物质可能为一种新的酸碱两性多烯类,极性较大的生物碱;JY-22发酵滤液依次经过乙醇沉淀,石油醚脱脂,正丁醇萃取,大孔树脂吸附(水和乙醇洗脱)、硅胶柱层析(氯仿:甲醇:浓氨水=8:2:0.2)、Sephadex LH-20柱层析二次(水甲醇洗脱)、制备高效液相分离(甲醇和含0.05%浓氨水的水洗脱)可获得JY-22主要活性产物。3.JY-22活性产物药效试验以烟草赤星病菌为靶菌,通过皿内抑菌圈法明确了JY-22正丁醇萃取物药效;通过JY-22正丁醇萃取物与吡唑醚菌酯(25%)复配确定其与农药是否具有增效作用。试验结果表明,JY-22正丁醇萃取物皿内药效试验抑菌浓度EC50为35.68 mg/L,EC90为408.08 mg/L。与作用方式不同的吡唑醚菌酯(25%)复配,V(吡唑醚菌酯4mg/L):V(JY-22正丁醇粗提物125 mg/L)=1:6时,以EC90值评价具有增效作用,吡唑醚菌酯使用量为1.21 mg/L,相比单独使用吡唑醚菌酯降低了20倍,JY-22正丁醇粗提物的使用量为227 mg相比单独使用JY-22粗提物降低了180 mg。