【摘 要】
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番木瓜(Carica papayaL)是世界著名的十大热带水果之一,与香蕉、菠萝并称为“热带三大草本果树”。番木瓜果实中富含大量的维生素和矿物质,其营养价值远高于苹果和梨等水果。为了保证番木瓜的品质和产量,在生产上种植的是雌雄同花的植株。但是雌雄同花的植株产生的种子包含2/3雌雄同花株(XYh)和1/3雌性株(XX),目前番木瓜种植模式通常采用每穴种植5棵苗以确保至少有一棵苗是雌雄两性株,待长到4
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番木瓜(Carica papayaL)是世界著名的十大热带水果之一,与香蕉、菠萝并称为“热带三大草本果树”。番木瓜果实中富含大量的维生素和矿物质,其营养价值远高于苹果和梨等水果。为了保证番木瓜的品质和产量,在生产上种植的是雌雄同花的植株。但是雌雄同花的植株产生的种子包含2/3雌雄同花株(XYh)和1/3雌性株(XX),目前番木瓜种植模式通常采用每穴种植5棵苗以确保至少有一棵苗是雌雄两性株,待长到4个月开花后辨认出雌雄两性株之后再砍掉雌性株。这样的种植模式,不仅增加人工和水分及肥料的成本,而且由于苗期的过度密植影响了番木瓜苗根系和树冠的发育,降低了植株抵抗病虫害的能力,延迟了收获期,降低了产量。所以,木瓜的性别分离成为了转基因番木瓜解决了环斑病毒的危害以后亟需解决的问题。本研究以番木瓜为实验材料,对番木瓜有性生殖相关基因开展了两方面的研究,第一部分研究胚发育关键基因CpXYh42的功能,通过拟南芥恢复验证,CRISPR/Cas9系统定向突变XYh中的CpXYh42基因,根据转基因植株果实中种子是否全部败育,来验证它们的生物学功能,同时利用EMS化学诱变结合TILLING技术寻找番木瓜CpXyh42基因突变体植株,根据突变体植株表型来进一步验证该基因的功能。第二部分以番木瓜花药为研究对象,划分花药发育时期进而对不同花药发育时期做RNAseq数据分析,弄清花药发育时期以及探索花药不同发育时期各基因的表达差异,为研究番木瓜性别决定以及花药发育调控网络奠定基础。主要结果如下:(1)通过拟南芥恢复验证,CpXyh42基因过表达可部分恢复拟南芥At5G14760基因突变体atao胚败育的表型,说明CpXYh42基因与拟南芥胚发育关键基因AO(At5G14760)的功能相似,可能是控制番木瓜胚发育的关键基因。(2)构建番木瓜CpXYh42XCRISPR、CpXYh42Y CRISPR 敲除载体和基因沉默载体以及CpXYh42X、CpXYh42Y过表达载体,农杆菌转化番木瓜。目前转化愈伤处于出芽和抗性筛选阶段,为验证CpXYh42基因在番木瓜体内的功能和进一步研究番木瓜胚胎发育的分子机理以及性别决定调控网络提供新的材料。(3)利用EMS诱变结合TILLING的方法筛选突变体植株,本实验通过EMS诱变中白番木瓜种子,最终得到了三棵突变体番木瓜苗,分别编号为cpxy14-Y、pxcpxy14和cpxy13-Y,由于EMS诱导碱基突变的随机性,本实验未能得到CpXYh42基因的突变体,这充分说明了EMS诱变番木瓜获得非转基因突变体的可行性,为人为改造番木瓜,获得性别不分离的番木瓜新种质资源提供新的思路。(4)通过石蜡切片和DAPI染色对番木瓜花药发育时期进行划分,将番木瓜花药发育时期分为五个时期:小孢子母细胞时期、减数分裂时期、四分体时期、第一次有丝分裂时期和成熟期。(5)转录组分析不同时期番木瓜花药发育过程的基因表达谱。按时间顺序,两两比较样品。五组数据中共找到10505个差异表达基因。BLASTP同源比较,搜索拟南芥数据库,共得到了 333个与生殖相关的基因。使用Nr数据库对10505个差异表达基因进行注释,其中6538个基因获得GO(Gene Ontology)注释,差异基因集中在生物催化活性、细胞代谢、发育以及生殖过程。富集到了 25个有意义的生物学通路,涉及细胞运输和代谢、信号转导、DNA复制和修复、转录和翻译、酶的代谢以及碳水化合物的代谢等。
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