背景：近年来由于供体器官的匮乏，严重制约了肝移植术在急性肝功能衰竭和慢性终末期肝病的临床应用。肝组织工程被认为是解决这一难题的手段之一。组织工程的核心内容是支架材料、种子细胞和细胞外基质。对于肝脏这样结构与功能十分复杂的实质性生命器官，研究人员在工程化构建肝脏整体框架和管道系统方面，面临巨大挑战。目前认为整体器官去细胞化技术是可以利用的最便捷途径。但即使获得了整体肝脏的框架和管道，也很难解决全部体积的肝实质细胞和非实质细胞以及细胞外基质的填充。考虑到患病肝脏还存在部分功能，且肝脏代偿和再生潜力巨大，能否利用原有肝脏整体结构在体进行部分肝叶的工程化重建，尚没有报道。在种子细胞研究方面，已有利用成熟大鼠肝细胞、胎肝细胞以及骨髓间充质干细胞等分离与培养，但肝细胞植入后如果不能与体内血循环尽快建立联系，则很难成活。在众多细胞外基质材料中，凝胶生物材料因易与细胞因子、组织细胞复合且具有流动性和可塑性的优点，有利于营养物质和代谢产物的运输及目标细胞的迁移，显示出了良好的应用前景。但是如何将生物相容性好的凝胶材料以最适合的浓度与目的细胞和细胞因子混合，并与外包膜及管道系统有机地融合为一体，形成肝组织器官尚没有报道。我们假设，种子细胞在含有细胞因子的凝胶材料支持下，可以均匀而稳定地种植于去细胞化的完整肝脏支架内，避免了该支架过于粗旷而缺乏衬垫的缺点，有利于细胞的粘附、生长和营养物质的传递。基于此，我们拟采用器官去细胞化技术获取部分肝叶的包膜和内在的管道系统，与细胞凝胶混合物复合，构建高度仿真性的工程化肝叶，为解决肝移植中的供体短缺奠定一定实验基础。目的：建立大鼠离体和活体原位部分肝叶去细胞化技术方法，构建肝叶整体及管道支架系统；制备肝细胞与含有生长因子凝胶混合物，并进行生物支架内灌注，在离体和活体原位构建仿真性的工程化肝叶。方法：1.大鼠部分肝叶支架制备：切除大鼠肝脏，阻断大鼠肝脏左叶，左外叶和中叶后，应用生物洗涤剂Triton和SDS序贯灌注方法，对离体部分肝叶进行灌注，获取去细胞化的部分肝叶支架；在体阻断门静脉、上下腔静脉和下下腔静脉，在下下腔静脉离断处置管作为流出道，在门静脉非离断情况下头皮针穿刺后，进行活体原位部分肝叶灌注，获取原位活体去细胞化部分肝叶支架。2.肝组织细胞的制备：胰酶消化法提取SD新生大鼠肝细胞，光学显微镜下大体形态观察鉴定。3.凝胶材料制备及浓度筛选：不同浓度鼠尾胶原制备及新生大鼠肝细胞与之共培养的增殖活性检测。4.高仿真性工程化肝叶的体外构建：鼠尾胶原混合新生大鼠肝细胞，制成高度生物化且可注射的复合型生物材料，灌注于离体去细胞化的部分肝叶支架内，构建肝叶，并进行体外短期培养。5.对体外构建肝叶进行组织形态学分析，包括常规切片、HE染色以及扫描电镜观察。6.活体原位工程化肝叶的构建及评价：凝胶、细胞及生长因子复合生物材料在活体原位注入去细胞化部分肝叶支架内，血循环再通24小时后进行评价。结果：1.部分肝叶去细胞后大体形态为具有完整包膜和清晰管道结构的透明支架，HE染色及电镜结果显示：支架含完整肝叶包膜及管道结构，无细胞及脂质存在。2.提取的新生大鼠肝细胞约为2×106/鼠肝，活率95%以上，倒置显微镜下观察，新提取肝细胞呈圆形，核大胞浆饱满，细胞体积较成熟肝细胞小。3. MTT检测结果显示：新生大鼠肝细胞增殖活性与鼠尾胶原终浓度成正比，依次为3mg/ml>2mg/ml>1mg/ml；4.工程化肝叶体外短期培养后，HE染色结果显示胶原在体外逐渐降解，细胞也随之死亡。但在血管及管腔周围，凝胶降解速度慢，细胞生长良好。电镜结果显示，肝细胞与凝胶均匀融合。5.在活体原位构建的工程化肝叶，血流再通24h后的HE结果显示，凝胶的降解较体外构建明显减缓，细胞在整个肝叶均匀分布，存活良好。结论：1.本研究在离体和活体原位成功制备了具有完整包膜及管道系统的部分肝叶支架，经细胞/凝胶/生长因子混合物的灌注，形成仿真工程化肝叶组织。2.离体构建工程化肝叶在体外静态培养条件下，凝胶材料降解快，细胞存活较少；而活体原位构建的工程化肝叶，由于及时与体内建立了血液循环，细胞存活良好。