【摘 要】
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目的:运用逆转录病毒作为载体,将端粒酶抑制基因导入肝癌细胞,从而使肝癌细胞生长受到抑制,细胞凋亡增多,为肝癌基因治疗提供新途径。 方法:使用逆转录病毒质粒载体pLXSN
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目的:运用逆转录病毒作为载体,将端粒酶抑制基因导入肝癌细胞,从而使肝癌细胞生长受到抑制,细胞凋亡增多,为肝癌基因治疗提供新途径。 方法:使用逆转录病毒质粒载体pLXSN构建的真核表达重组质粒pLXSN-hTR,携带反义端粒酶RNA基因,将其用电穿孔的方法转染包装细胞PA317细胞及PT67细胞,G418筛选抗性细胞,获取阳性细胞克隆株,即稳定表达病毒的产病毒细胞株,收集培养上清液中的重组病毒,用NIH3T3细胞测定病毒滴度。将获得的重组病毒离心浓缩后直接感染人肝癌细胞系Bel7402,PCR检测目的基因的插入,端粒酶反义RNA组分整合入肝癌细胞基因组中,通过其在细胞内的表达抑制肝癌细胞端粒酶的活性,从而抑制肝癌细胞的生长,并促进癌细胞凋亡。我们通过细胞生长曲线和MTT法检测细胞生长抑制率。这为以后的重组逆转录病毒在体内感染肿瘤细胞,从而使肿瘤的基因治疗成为可能。 结果:使用构建成功的逆转录病毒真核重组质粒pLXSN-hTR,将其用电穿孔的方法转染包装细胞PA317细胞及PT67细胞,转染效率可达27.2%和33.6%,G418筛选抗性细胞,获取阳性细胞克隆株,即稳定表达病毒的产病毒细胞株,收集培养上清液中的重组病毒,用NIH3T3细胞测定病毒滴度,正义病毒和反义病毒滴度分别为2.7x10~5cfu/ml和3.9x10~5cfu/ml。将获得的重组病毒直接感染人肝癌细胞系Bel7402,PCR检测感染成功,端粒酶反义RNA组分整合入肝癌细胞基因组中,通过其在细胞内的表达抑制肝癌细胞端粒酶的活性,从而抑制肝癌细胞的生长,并促
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