论文部分内容阅读
金花茶（Camellia nitidissima）被誉为“茶族皇后”、植物界“大熊猫”,其特异的金黄花色为其增加了很大的观赏性,也是开展黄花茶花育种的珍稀遗传资源。为了解金花茶特异金黄花色形成的主要呈色物质与代谢过程、挖掘其调控的关键基因、解析其调控机制,本研究以金花茶为主要研究材料,对其花色形成与细胞内主要环境因子的关系进行分析,测定花色形成相关的主要组分的含量,通过转录组测序挖掘金花茶花色调控的关键基因,并对花色调控的关键基因进行克隆和功能验证等,从生理与分子层面揭示金花茶花朵的呈色物质的代谢机理及分子调控机制,为黄花山茶分子育种打下基础。（1）以9种金花茶组植物为试材,测定了其花瓣的颜色、总黄酮含量、含水率、细胞pH、7种金属离子浓度,分析其与花色形成的关系。所测金花茶的花色平均值明度L*为80.82、色相a*为-2.88、色相b*为53.97、彩度C*为54.10、色相角h为93.19,金花茶花色为明度较亮的黄色,色相b*为描述黄色的主要指标。花瓣总黄酮鲜重含量平均为20.17%,花瓣含水率为88.14%,均与花色呈弱负相关,对黄色呈现影响较小。花瓣细胞pH平均值为6.19,偏弱酸性,与花色呈显著正相关。7种金属离子在所测植物间均存在显著差异,其中K+含量最高,平均12.61 mg·g-1,Cu2+含量最低,平均0.0038 mg·g-1,Al3+、Fe3+和Ca2+与花色呈负相关。中偏弱酸性细胞环境与低浓度的Al3+、Fe3+和Ca2+有利于金花茶花瓣黄色的呈现。（2）利用HPLC方法测定了花色不同的23种金花茶全开期的花朵及6种金花茶5个花芽发育时期的花朵中12种类黄酮、9种多酚、5种类胡萝卜素、2种花青素苷的含量。所测物种可分为5大类:金黄色、橙黄色、黄色、浅黄色和红黄相间,开花过程中花色黄度指标（色相b*）主要呈先升高后降低的趋势。金花茶花朵中的主要组分是黄酮和多酚。黄酮类主要组分是槲皮素7-O-葡萄糖苷（Qu7G）、槲皮素3-O-葡萄糖苷（Qu3G）和芦丁（Ru）;多酚类主要组分是表儿茶素（EC）、表没食子儿茶素（EGC）和儿茶素（C）。花青素苷仅少量物种的花瓣或萼片中检测到,成分主要是矢车菊素3-葡萄糖苷（Cy3G）。类胡萝卜素的含量整体较低,不是花色的主要组分,成分主要是玉米黄质（Zea）、叶黄素（Xan）和β-胡萝卜素（β-Ca）。花色黄度指标（色相b*）主要与Qu7G、Qu3G和黄酮总量（TF）呈正比。花朵呈色的主要代谢物质是黄酮类的Qu7G、Qu3G。（3）利用Pac Bio RS II三代全长转录组结合二代Illumina测序的方法,以金花茶（C.nitidissima）不同组织和花色深浅不同的花芽为材料,进行花色调控关键基因的挖掘。三代全长转录组测序共获得19.13 Gb clean data数据;Illumina测序共得到264.40 Gb Clean Data,Q30达到93.17%;分析得到差异表达基因67 018条。结合HPLC测得的花色呈色物质数据,进行差异基因与花色主要呈色物质指标（Qu7G/Qu3G/TF）相关性分析发现FLS基因与Qu7G/Qu3G/TF具有高度的相关性,是重要的候选功能基因;MYB转录因子与Qu7G/Qu3G/TF显著相关的基因数量较多,是重要的转录因子。WGCNA分析发现FLS是主要的Hub基因,F3’H、CHS与其关系密切是共表达的基因;MYB111是关键模块中与Qu7G/Qu3G/TF显著相关的转录因子。（4）PCR扩增得到CnFLS、CnF3’H、CnDFR、CnUFGT14、CnUFGT15、CnMYB111基因,利用实时荧光定量PCR测定基因在金花茶不同组织中的表达量,并进行基因的亚细胞定位观察和利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草验证基因的功能。金花茶花瓣中,CnFLS的表达量与花色黄度（色相b*）成正相关,而CnF3’H、CnDFR等与花色黄度（色相b*）成负相关。在CnFLS的阳性株系花朵中,多酚含量较野生型烟草的差异均不显著;黄酮醇组分（槲皮素3-O-芸香糖苷Qu3R、Qu7G和Qu3G）的含量显著升高,但黄酮醇的含量总体很低未使转基因本氏烟草发生花色上的变化。CnF3’H的阳性花朵中,多种多酚组分和黄酮组分的含量均显著高于野生型烟草,但多酚的增加量明显高于黄酮的增加量。在CnDFR的阳性花朵中,多酚组分在阳性株系显著高于野生型烟草,而未检测到花青素苷类物质。CnFLS基因主要促进合成黄酮醇,CnF3’H基因主要促进多酚的合成,CnDFR基因主要促进二氢槲皮素（DHQ）合成多酚。而CnUFGT14、CnUFGT15和CnMYB111过表达后没有促进合成黄酮醇,对黄色花的调控作用不显著。（5）构建双基因表达载体,转化烟草进行基因相互作用验证。转CnFLS+反义CnF3’H基因后,多酚的含量相对降低,黄酮的含量升高,降低了CnF3’H基因对多酚合成的促进作用,同时促进了黄酮的积累;转CnFLS+反义CnDFR基因明显抑制了多酚的合成,但因其表达量较低,对黄酮的促进作用并不显著;转CnFLS+CnUFGT14基因对多酚的合成作用并不明显,对黄酮合成的促进作用要大于单独转CnFLS基因。综上,金花茶花瓣中偏弱酸性的细胞pH和低浓度的Al3+、Fe3+和Ca2+为金黄花色的形成提供有利条件,合成了较多的Qu7G、Qu3G等黄酮醇类物质。主要由CnFLS基因正调控,CnF3’H、CnDFR等基因负调控。过表达FLS基因,同时抑制F3’H、DFR的表达更利于黄色花的形成。