研究内容: 1．基因芯片检测出不同剂量60Coγ射线照射人淋巴母细胞(AHH-1)及与其共同培养未照射细胞差异表达基因谱。利用生物信息学方法分析筛选辐射旁效应相关差异表达基因。 2．对候选辐射相关和旁效应相关的基因进行分子生物学验证，得到的阳性结果进一步分析功能和可能在辐射效应或旁效应中的作用，探寻可能的存在的机制。 研究方法: 1．芯片数据的生物信息学分析方法主要是使用生物信息学软件、在线软件和网络数据库对数据进行聚类分析、功能分析、序列比对和进化树的构建。 2．重复芯片样品准备，生物学验证主要使用PCR的方法检测样品中各基因RNA的表达量。 3．照射细胞和旁效应细胞长期培养、加入磷酸化抑制剂，检测蛋白活性的变化。 4．统计学方法：单样本t检验、单因素方差分析 结果: 1．γ射线直接照射细胞及其旁效应细胞基因表达谱： 与正常对照组比较：2.0Gy旁效应细胞(P2.0)中有上调基因107个，下调基因6个；0.5Gy旁效应细胞(P0.5)中有上调基因57个，下调基因8个；2.0Gy直接照射细胞(Z2.0)中有上调基因90个，下调基因349个；0.5Gy直接照射细胞(Z0.5)中有上调基因67个，下调基因29个．其中17个基因表达随剂量增大而增大，6个基因低剂量下调而高剂量和共培养细胞上调：分析仅在Z0.5变化的基因在P0.5中变化明显，提示旁效应的产生与照射剂量有关。 2．聚类分析结果： 筛选的差异表达基因在GO功能分类中细胞膜蛋白、细胞联接、周期相关和物质转运蛋白占了绝大部分，同时它们参与了转录、翻译、细胞周期、离子转运、细胞凋亡、氧化还原、氧化磷酸化等功能模块。研究者认为细胞受到低剂量照射的刺激后并非直接死亡，却间接刺激了膜分泌和细胞间通讯。 3．Z0.5和P0.5均明显变化的基因： BAX，ZNF652，GINS4，FOS，AP1S1，PTPRJ(CD148，PTP受体家族的一种酩氨酸磷酸酶)在Z0.5和P0.5表达均明显变化。表明这些基因与低剂量照射生物学效应发生有关。进化树中可以看出GINS4(目前GINS4还无G0分类)和ZNF652(锌指蛋白652)距离较近，AP1S1(AP-1家族网格蛋白(Clathrin)的一种)和他们也相近，AP1S1、GINS4和ZNF652在结构和功能上可能有某种联系，且四个均与基因转录调控、细胞分泌有关，只有BAX(Bcl-2相关蛋白x)的五种蛋白和他们距离较远说明他们发生相互作用的可能性很小， 4．与照射剂量关系不大的蛋白序列比对结果： 一些基因在0.5Gy照射和2Gy照射均发生变化，我们将这些基因所表达的蛋白进行多序列比，果均显示PAPLN(原肠(胚)形成糖蛋白)与假定蛋白LOC375010距离较近，并且与BAX的5种蛋白较远，提示PAPLN和LOC375010在结构和功能上可能有某种内在联系。 5．多种锌指蛋白在直接照射细胞和旁效应细胞表达变化：在芯片结果中我们发现多种锌指蛋白在直接照射细胞和旁效应细胞表达变化．发现ZNF423同家族的成员参与了生长因子TGF-β的信号通路，同时在芯片数据中发现锌指蛋白家族ZC3H7A参与了TGF-β1信号通路；受到2Gy照射后上调2.2倍，编码TGF-β1的基因在受到2Gy照射后也上调1.8倍。 6．对功能未知差异表达基因的生物信息学分析结果： 对一些还无分类，功能未知的差异表达基因在NCBI上BLAST未发现相似度较高的信息。发现候选癌基因CACS4与假定蛋白LOC375010距离较近，可能在功能上有某种联系． 7．可能与辐射诱导的旁效应关系密切的基因功能分析 根据芯片数据聚类结果和基因信息查询结果，发现一些细胞通路中重要的基因，通过网络数据库发现很多差异表达基因在TP53相关细胞周期通路、BAX相关凋亡通路和TGF-β信号通路中。 8．通过对芯片分析筛选基因中15个目前还未报道与辐射或旁效应相关的候选基因验证实验发现，表达均有显著改变。 8.1跨膜相关的差异表达基因：PTPRJ、PAPLN和VDAC3(电压门控通道3)；PTPRJ在低剂量直接照射和旁效应细胞中表达明显下调(P＜0.05)，RT-PCR也验证了它的下调，在2.0Gy直接照射细胞中也有明显下调(P＜0.05)。PAPLN照射以后上调而旁效应无明显变化，验证实验确发现照射后明显下调。VDAC3旁效应细胞中RNA表达变化与芯片数据一致，其对于低剂量和高剂量辐射反映呈相反趋势，在低剂量直接照射和旁效应细胞中表达明显下调，在高剂量直接照射和旁效应细胞中表达明显上调。 8.2胞内物质转运相关的基因：AP1S1，PDP2(丙酮酸脱氢磷酸酶2)；AP1S1 RNA表达在直接照射组细胞变化不显著，而在旁效应细胞中表达显著增高(P＜0.05)，并随着剂量增加而增加，与芯片结果一致。PDP2在Z0.5和P0.5上调，Z2.0下调明显，与芯片一致；而在P2.0细胞中却没有显著变化 8.3核内转录调节，与细胞周期凋亡相关的差异表达基因：ZNF652、FOS、TPR、ZMAT3(P53相关锌指蛋白)、CFLAR；qPCR结果显示ZNF652在Z0.5，P0.5中明显上调(P＜0.05)，与芯片一致，Z2.0也有明显上调(P＜0.05)。FOS在Z2.0细胞中RNA与芯片数据一致，无明显表达变化，Z0.5，P0.5，P2.0变化没有芯片显著，但是也都明显下调(P＜0.05)。TPR照射细胞中RNA表达变化与芯片数据一致，在Z0.5细胞中表达下调(P＜0.05)。ZMAT3在Z0.5，P0.5，P2.0细胞中RNA表达变化与芯片数据一致，在0.5Gy和2Gy照射均有上调(P＜0.05)，并且0.5Gy上调较明显；CFLAR在Z2.0，P0.5，P2.0细胞中RNA表达变化与芯片数据一致．在Z2.0细胞中明显下调，而Z0.5和P0.5旁效应细胞中却明显上调(P＜0.05)， 8.4差异表达的未知基因：LOC375010、C120rf5(染色体开放读框，又名TIGAR)、GINS4(GIN蛋白复合体4)；LOC375010在Z2.0细胞中RNA表达明显上调(P＜0.05)，在旁效应中变化比芯片显著，有上调趋势。C12orf5在其他发表的辐射相关芯片数据中也发现有下调，我们芯片数据中在Z2.0有明显下调，RT-PCR验证发现Z2.0确实有明显下调(P＜0.05)，而Z0.5和P0.5却上调明显，P2.0下调。 9．Caspase8(半胱氨酸蛋白水解酶8)检测 照射和旁效应细胞中Caspase8活性有降低的现象，多次相同剂量照射均有明显降低(P＜0.05)，但是加入磷酸化抑制剂后这种变化消失(各样本中)，Caspase8酶活性均降为同一水平。细胞培养30天后发现照射细胞Caspase8酶活性增加(P＜0.05)，而旁效应细胞中却无明显改变。 结论: 1．γ射线直接照射细胞可导致与其共同培养的旁效应细胞产生众多差异表达基因。发现一些基因在各剂量组照射细胞中均发生变化，提示这些基因的变化可能在一定剂量范围内与照射剂量关系不大；一些基因的变化在一定剂量范围内直接和间接照射效应相似，提示旁效应的产生与可能照射剂量有关。 2．从聚类结果可以发现差异表达基因中细胞连接通讯占很大部分；旁效应研究者认为细胞受到低剂量照射的刺激后并非直接死亡，却间接刺激了膜分泌和细胞间通讯。这些数据结果和辐射诱导旁效应的观点相吻合。一些细胞通路中出现的重要的差异表达基因，很可能参与到辐射旁效应机制中。部分磷酸酶受体分子的下调可能与低剂量辐射反应信号因子传递有关。 3．多序列比对发现一些可能有相互作用的差异表达基因，它们的核酸或蛋白序列距离较近。对未知基因的分析与验证，可能有助于新功能的发现和低剂量辐射机制的深入研究。 4．验证结果大部分与芯片数据一致，表明这些基因在照射或旁效应机制中可能起了重要作用。AP1S1，FOS(一个FBJ病毒癌基因，可抑制癌细胞的迁移)，TPR和膜通道蛋白VDAC3，PTPRJ在旁效应细胞中改变与芯片一致，可能与低剂量辐射反应信号因子传递有关，ZNF652照射和旁效应中的反应和肿瘤细胞相反，表达上调结合抑瘤基因的功能增强，ZMAT3也同样上调，他们可能在DNA损伤的修复过程中起作用，有进一步深入研究的价值。 5．照射细胞和旁效应细胞中Caspase8酶活性有降低的现象(P＜0.05)，加入磷酸化抑制剂以后这种变化消失，Caspase8酶活性均降为同一水平。可能因为低剂量的电离辐射及其诱导的旁效应可以诱导凋亡相关蛋白的上调(BAX，CFLAR，ZMAT3，TIGAR等)，这些蛋白作用于被激活的Caspase8或P53通路，使得Caspase8活性下降。而加入磷酸化抑制剂以后，可能抑制了大量磷酸酶的作用使得Caspase8活性降低。并且在照射细胞和旁效应细胞中远期效应可能不同。需要进一步对相关蛋白研究来验证这一现象。