背景关于肿瘤的发生、发展、侵袭、转移和治疗一直是医学研究的热点。传统观点认为，肿瘤由成熟细胞突变而来，是由均一的肿瘤细胞共同增殖构成的，所有肿瘤细胞都有无限增殖能力。因此临床上常以肿瘤体积是否缩小或消失作为衡量肿瘤疗效的一个标准。但临床上许多肿瘤患者，在手术切除肿瘤或经过其他治疗，病情已获稳定一段时间后，却又出现肿瘤的复发或转移，不能获得彻底治愈。新近研究发现：肿瘤组织中存在极少量干细胞样亚群，它具有无限增殖的潜能，在启动肿瘤形成和生长中起着决定性的作用，而其余的大多数细胞，经过短暂的分化，最终死亡。肿瘤生长是肿瘤组织中极少量具有特殊表面标志的肿瘤干细胞增殖的结果。这提示肿瘤治疗应针对在肿瘤发生、发展中起决定性作用的肿瘤干细胞，而不是大部分无增殖、分化能力的肿瘤实体细胞。这可能促进肿瘤治疗学发生革命性改变。肿瘤干细胞理论提示肝癌可能也来源于肝癌干细胞（hepatoma stem cells）。分离、培养、鉴定肝癌干细胞并研究其性质具有重要意义。肿瘤干细胞研究的难点在于确定其特异性表面标志或表面标志的组合方案。应用有针对性的抗原去检测细胞亚群的表面标志将节省大量的时间和研究经费，并有望形成高效的分选方案。研究发现，利用正常干细胞标志物组合，将肿瘤细胞分选成不同亚群后行体外增殖、分化能力及体内成瘤能力验证，可能是从肿瘤组织中分离肿瘤干细胞的一种行之有效的办法。由于缺乏适宜的培养方法和高效的分选方案，目前尚未见成功分离、鉴定与培养肝癌细胞中干细胞亚群的报道。根据上述研究结果，利用肝脏干细胞的部分表面标志，在此基础上进行体外增殖、分化试验和体内成瘤试验，有望分离出肝癌干细胞并建立高效的分选方案。因此，本课题采用肝脏的干细胞—卵圆细胞的部分表面标志来进行肝癌干细胞的分选。卵圆细胞是肝脏中的一类干细胞，具有双向分化潜能，既可分化为肝细胞又可分化为胆管细胞。近来一系列相关研究支持卵圆细胞产生肝癌的观点，提示可以利用卵圆细胞的部分表面标志进行肝癌干细胞的分选。我们在前期的研究中原代培养原发性肝癌（primary hepatic carcinoma，PHC；肝细胞癌：hepatocellular carcinoma，HCC）细胞，选用卵圆细胞表面标记CD34、c-kit、Thy-1、CK7、CK14和CK19，通过亲和板结合分离法分离肝癌细胞亚群，发现以CD34、c-kit、CK7等3个标记分选的相应的细胞亚群之间裸鼠移植成瘤能力差异有统计学意义（P＜0.05）。降低移植细胞的数量后，CD34^-、CK7⁺、c-kit⁺肝癌细胞亚群成瘤能力仍强于对应的CD34⁺、CK7^-、c-kit^-肝癌细胞亚群，但细胞移植成瘤率下降。出现上述结果的原因可能有两个：一是因为亲和板结合分离法所得亚群细胞纯度不高，混杂细胞影响了成瘤结果；二是仅仅靠单一表面标志抗原进行分选所得的亚群细胞无法完全将肝癌干细胞与非肝癌干细胞分离。另外，成瘤结果的统计学分析显示，分选后细胞亚群成瘤能力差别较大的表面标志依次是c-kit、CK7、CD34。因此，利用分选效率和分选细胞纯度较高的分选方法，依次以上述3种表面标志或其组合及体内外增殖、成瘤能力验证有望从肝癌细胞中分离肝癌干细胞。目的1．比较流式细胞仪、免疫磁珠及亲和板结合分离法等3种方法分选肝癌亚群细胞的效果，确定分选肝癌亚群细胞的合理方法；2．从肝癌细胞中分离、培养、鉴定干细胞亚群，确定肝癌细胞中干细胞亚群的分选方案；3．初步研究肝癌细胞中干细胞亚群的生物学特性。方法1．原代培养肝癌细胞，分别以流式细胞仪、免疫磁珠及亲和板结合分离法分选c-kit⁺肝癌细胞亚群。然后使用流式细胞仪检测亚群细胞中c-kit⁺肝癌细胞的纯度，计算不同方法分选的回收率；以台盼蓝染色检测细胞的活力；CCK-8法检测细胞增殖能力（刺激指数：Stimulation index，SI）；将不同亚群细胞移植到裸鼠腋背部检测其成瘤率。2．对3种分选方法所得的细胞悬液中c-kit⁺肝癌细胞的纯度、回收率、活力、增殖能力、移植瘤成瘤率采用One-Way ANOVA检验进行统计学分析，如P＜0.05则进一步行组间LSD两两比较。流式细胞仪分选前后的细胞悬液中细胞的活力、SI的比较用独立样本的t检验。确定分离肝癌亚群细胞的较佳方法。3．原代培养肝癌细胞，先分别以c-kit、CK7为标记物，利用流式细胞仪分选得到c-kit⁺亚群细胞和c-kit^-群细胞、CK7⁺亚群细胞和CK7^-亚群细胞。将不同亚群细胞移植到裸鼠腋背部检测其成瘤率。4．如c-kit^-亚群细胞和CK7^-亚群细胞均还有部分成瘤能力，则进一步以c-kit、CK7的组合利用流式细胞仪进行双阳性分选得到c-kit⁺CK7⁺细胞亚群和对应的非c-kit⁺CK7⁺细胞亚群。将不同亚群细胞移植到裸鼠腋背部检测其成瘤率。5．如c-kit⁺CK7⁺细胞亚群裸鼠异体移植后全部可成瘤，而对应的非c-kit⁺CK7⁺细胞亚群移植后无成瘤能力，则进一步提取c-kit⁺CK7⁺细胞亚群的移植瘤细胞，利用流式细胞仪分选得到c-kit⁺CK7⁺细胞亚群和对应的非c-kit⁺CK7⁺细胞亚群，再次将不同细胞亚群移植到裸鼠，检测其成瘤率。6．根据上述各亚群细胞的成瘤能力和子代细胞的成瘤能力，确定肝癌细胞中的干细胞亚群及其分选方案；7．继续培养肝癌细胞中的干细胞亚群和对应的非干细胞亚群，观察其生物学特性：光镜观察培养不同时间的细胞形态；透射电镜观察细胞的超微结构；CCK-8法检测并计算细胞的SI；流式细胞仪检测细胞周期和传代培养后亚群细胞中c-kit⁺CK7⁺细胞的比例。对两亚群细胞的SI、c-kit⁺CK7⁺细胞的比例、细胞周期、凋亡细胞比例采用两独立样本的t检验进行统计分析，初步确定肝癌细胞中干细胞亚群的生物学特性。结果1．流式细胞仪、免疫磁珠及亲和板结合分离法等3种方法分选肝癌亚群细胞的效果比较：流式细胞仪、免疫磁珠及亲和板分离法分选所得的c-kit⁺肝癌细胞活力（分别为93.16％±4.36％、93.68％±3.20％、94.46％±3.02％）、增殖能力（SI分别为0.92±0.11、0.87±0.13、0.95±0.05）和成瘤率（分别为88.00％±10.95％、88.00％±10.95％、96.00％±8.94％）之间差异无统计学意义（P＞0.05）；分选后c-kit⁺肝癌细胞纯度（分别为99.42％±0.54％、90.64％±4.29％、71.34％±5.22％）、回收率（分别为84.40％±3.56％、85.76％±3.72％、63.16％±4.78％）之间差异有统计学意义（P＜0.05）；进一步两两比较显示：3种分选方法分选后的c-kit⁺肝癌细胞的纯度之间差异均有统计学意义（P＜0.05）；纯度从高到低依次为流式细胞仪分选、免疫磁珠分选、亲和板结合分选；亲和板结合法分选c-kit⁺肝癌细胞的回收率低于其他2种分选方法（P＜0.05）；流式细胞仪分选与免疫磁珠分选2种方法分选c-kit⁺肝癌细胞的回收率差异无统计学意义（P＞0.05）。流式细胞仪分选前后细胞悬液中细胞的活力（分选前后分别为94.04％±3.27％、93.16％±4.36％）、增殖能力（分选前后的SI分别为1.02％±0.08％、0.92％±0.11％）之间的差异均无统计学意义（P＞0.05）。2．以c-kit、CK7单阳性分选所得亚群细胞的移植成瘤结果：以c-kit为标志分选的c-kit⁺亚群细胞和c-kit^-亚群细胞成瘤率分别为9／10和2／10；以CK7为标志分选的CK7⁺亚群细胞和CK7^-亚群细胞成瘤率分别为8／10和1／10；仍有部分c-kit^-和CK7^-肝癌细胞具有成瘤能力，提示仅仅利用这两个表面标志进行单一标志的分选不能完全获取肝癌细胞中的干细胞亚群。3．以c-kit、CK7双阳性分选所得亚群细胞的移植成瘤结果：采用c-kit和CK7进行双阳性分选得到的c-kit⁺CK7⁺亚群细胞和对应的非c-kit⁺CK7⁺亚群细胞的裸鼠异种移植成瘤率分别为10／10和0／10。c-kit⁺CK7⁺亚群细胞的裸鼠移植瘤细胞提取后，流式细胞仪检测c-kit⁺CK7⁺亚群细胞与非c-kit⁺CK7⁺亚群细胞所占比例，结果显示与原代HCC细胞中两亚群细胞所占比例类似（分别为0.8％、99.2％）；分选后c-kit⁺CK7⁺亚群细胞移植裸鼠后，成瘤结果亦与原代肝癌细胞分选后的移植成瘤结果类似：c-kit⁺CK7⁺亚群细胞具有100％的成瘤能力，而非c-kit⁺CK7⁺亚群细胞无移植成瘤能力。原代肝癌细胞分选后所得的移植瘤与移植瘤细胞分选后移植所重建的肿瘤HE染色和AFP染色结果类似。4．c-kit⁺CK7⁺亚群细胞生物学特性观察：原代肝癌细胞为纯化的上皮样生长细胞，有梭形、多角形等多种形态细胞；分选后的c-kit⁺CK7⁺肝癌亚群细胞培养24 h时为多角形细胞，随着传代次数的增加出现梭形、多角形细胞混合存在；而对应的非c-kit⁺CK7⁺肝癌亚群细胞培养24 h时为梭形，随着传代次数的增加细胞形态未见明显改变，未出现多角形细胞。透射电镜观察c-kit⁺CK7⁺肝癌亚群细胞体积较大，核浆比例亦大；核形态不规则，核仁明显；胞浆内可见核糖体及线粒体。非c-kit⁺CK7⁺细胞核大，表面畸形，核仁明显，常染色质均匀；胞浆内可见核糖体及线粒体。c-kit⁺CK7⁺肝癌亚群细胞的SI（0.724±0.13）较非c-kit⁺CK7⁺肝癌亚群细胞SI（1.24±0.09）低，增殖能力差（P＜0.05）。随着细胞培养、传代次数的增加，c-kit⁺CK7⁺细胞亚群中c-kit⁺CK7⁺细胞的比例逐渐降低，在培养第10代时降低到与分选前细胞一致，约0.8％。c-kit⁺CK7⁺细胞亚群的大部分细胞（60.33％±2.74％）都处于G0／G1期，显著高于非c-kit⁺CK7⁺细胞亚群（49.24±2.79）。非c-kit⁺CK7⁺亚群细胞与c-kit⁺CK7⁺亚群细胞比较，无论是S期比例，还是（S+G₂／M）均高，说明其体外增殖能力较强。非c-kit⁺CK7⁺细胞亚群中凋亡细胞的比例高于c-kit⁺CK7⁺细胞亚群中凋亡细胞的比例（t=4.903，P=0.008）。移植瘤细胞提取后，流式细胞仪检测c-kit⁺CK7⁺亚群细胞与非c-kit⁺CK7⁺亚群细胞所占比例，结果显示与原始HCC标本中两亚群细胞所占比例类似。结论1．流式细胞仪分选所得到的c-kit⁺肝癌细胞纯度、回收率最高；3种方法所得细胞之间的细胞活力、增殖能力、移植成瘤率差异无统计学意义。流式细胞仪分选前后的细胞之间活力、增殖能力差异无统计学意义，提示流式细胞仪分选是分选肝癌亚群细胞的较合理方法。2．利用流式细胞仪对肝癌细胞进行c-kit、CK7双阳性分选得到的c-kit⁺CK7⁺细胞亚群具有干细胞特性，可能是肝癌中的肿瘤干细胞。3．c-kit⁺CK7⁺亚群细胞具有形成异质性子代细胞的能力；大部分细胞处于G0／G1期；增殖能力差；具有干细胞特性，表现出更为原始的细胞特性。