[目的]1、检测S-D大鼠结膜成纤维细胞中血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF)及其受体,以及炎症因子的mRNA表达情况。2、研究贝伐单抗(anti-VEGFA, Avastin)对大鼠结膜成纤维细胞生长曲线的影响,以及对结膜成纤维细胞中血管内皮生长因子、炎症因子表达的影响。3、评价贝伐单抗对大鼠滤过泡形态学影响以及滤过泡内血管内皮生长因子、炎症因子的影响。[方法]1.结膜成纤维细胞(Fibroblasts, FBs)培养及鉴定：以5只出生后4周的S-D大鼠为实验对象,剪取结膜下组织,应用组织块法接种于培养基并培养。观察FBs生长。传代至第5代后,将培养的S-D大鼠的FBs分别接种于96孔板,分别在24小时、48小时、72小时、120小时、7天、14天共六个时点,用MTT法测量细胞密度并绘制S-D大鼠FBs的正常生长曲线。取对数生长期的培养的第四和第五代FBs,以间接免疫荧光法鉴定。阳性对照为波形蛋白荧光染色(Vimentin—FlTC),阴性对照为角蛋白荧光染色(Keratin-FITC)。2.FBs中生长因子和受体的表达：取第四代和第五代培养的S-D大鼠的FBs,以间接免疫荧光法鉴定VEGFR1的荧光表达。根据Primer blast程序及参考文献设计VEGF164, VEGFR1(Flt-1), VEGFR2(Flkl), TGFβ1和TGFβ2五种基因的RNA引物序列。以Trizol法提取FBs中的mRNA,在RNA反转录酶作用下,合成cDNA,以25u I体系行PCR扩增。配制2%琼脂糖凝胶并跑胶。对目的条带切胶纯化后进行基因测序。测序结果进行NCBl Primer Blast比对,以验证扩增的片断是否属于目的基因序列。3.贝伐单抗对培养的结膜FBs生长的影响：以离体培养的大鼠第五代结膜FBs为对象,在96孔板中加入不同浓度的贝伐单抗干预FBs生长。贝伐单抗的终浓度分别为12.5mg/ml、25mg/ml、1.25mg/ml、0.5mg/ml、0.05mg/ml、0.005mg/ml,并设置5个复孔。观察时点为第1天、第2天、第4天、第6天、第8天、第10天。分别以MTT法检测FBs生长状况,绘制不同浓度贝伐单抗干预下FBs的生长曲线。以2.5mg/ml(最适干预浓度)的贝伐单抗干预6孔板培养的第六代FBs细胞,提取培养48小时FBs细胞的mRNA。通过反转录合成cDNA。用ABI7500荧光定量PCR反应仪进行PCR扩增及检测,绘制标准曲线对扩增效率进行检验及熔解曲线对扩增特异性进行检验。对VEGF164, VEGFR1(Flt-1),VEGFR2(Flk1), TGF β1, TGFβ2行荧光定量PCR检测,根据扩增曲线及ddCt值进行统计,检测五种基因的mRNA表达丰度变化。4.贝伐单抗对大鼠眼外滤过术后滤过泡形态的影响：以55只出生后4周的S-D大鼠为实验对象,进行分组。5只大鼠的单眼用于眼外滤过手术模型的建立。干预研究分为A1组、A2组和B组。A1组(贝伐单抗干预组)：共25只眼(25只大鼠),在每个时间点(共5个时点),选5只大鼠的一只眼行眼外滤过联合贝伐单抗结膜下注射(5眼/时点×5个时点)；A2组(另眼对照组)：共25只眼(与A1组为同一组大鼠),在与A1组相同的每个时间点,选5只大鼠的另只眼行滤过手术联合PBS结膜下注射(5眼/时点×5个时点)；B组(单独对照组)：共25只眼(25只大鼠),在与Al组相同的每个时间点,选5只大鼠的一只眼行滤过手术联合PBS结膜下注射(5眼/时点×5个时点)。首先对5只大鼠进行眼外滤过手术,以上方角膜缘为基底,制作大鼠眼外滤过手术模型并建立标准化手术步骤。连续观察术后滤过泡形态及前节变化至第14天,记录形态学改变及不良事件。对50只大鼠施行眼外滤过联合结膜下注药术。干预方法为盲法随机注射贝伐单抗或PBS缓冲液3μl于下方穹隆结膜。观察时点为第1天、第2天、第3天、第5天、第8天(根据细胞生长曲线及滤过泡术后形态变化设定)。观察项目为：滤过泡形态(0～3级)；滤过泡充血(0～3级)；不良事件,包括前房出血(0～3级)、虹膜变化(0～3级)和其它不良反应。根据观察记录进行Kruskal-Wallis H检验；进一步进行两两比较：采用秩变换,以秩次代替原变量进行方差参数分析。5.贝伐单抗对大鼠滤过泡中生长因子和受体表达的影响：选择在第五部分接受眼外滤过联合结膜下注药术的三组S-D大鼠。分别在第1天、第2天、第3天、第5天、第8天五个时间点将实验动物处死剪取滤过泡组织,并即刻液氮冷冻保存。在统一时间以Trizol法提取mRNA,并逆转录为cDNA。经ABI7500荧光定量PCR检测。检测目的基因包括：VEGF164， VEGFRl(Flt-l), VEGFR2(Flkl)、TGF β1、TGF β2及内参照β-actin。结果采用One-Way ANOVA检验,比较在不同时间点,三组样本中各基因的RNA表达差异。各时点采集的滤过泡标本以Trizol法提取mRNA的同时提取组织总蛋白,采用Western-blotting法检测在不同时间点的三组样本中,VEGFA、TGFβ1和TGF β2蛋白表达情况的差异。[结果]1.体外培养S-D大鼠结膜FBs的形态学特征和生长曲线：S-D大鼠的结膜囊组织块在接种6小时内大部分贴壁。第3天可见FBs自组织块边缘长出,经1：1传代后,约7天可达80%融合。大鼠结膜组织培养后的FBs细胞较短,可见分枝状、多角形及不规则形细胞。MTT法检测显示,FBs的对数生长期为第2-7天,第8天后进入平台期。2.培养大鼠结膜FBs的免疫荧光鉴定结果：间接免疫荧光法染色可见S-D大鼠结膜FBs波形蛋白荧光染色阳性,角蛋白荧光染色阴性。3.培养大鼠结膜FBs中生长因子和受体的表达：间接免疫荧光法染色见细胞膜上VEGFR1呈弱阳性表达。逆转录产物测序结果均符合目的基因序列(VEGF164、Flt-1、Flk1、TGFβ1和TGF β2)。引物经扩增曲线检验,证实扩增效率一致。4.贝伐单抗对培养结膜FBs生长曲线影响：对处于对数生长期的FBs按照不同浓度梯度进行贝伐单抗干预后显示,终浓度为2.5mg/ml的贝伐单抗对FBs生长具有更显著的抑制作用。终浓度为12.5mg/ml的贝伐单抗干预后,FBs在24小时内死亡。5.贝伐单抗(2.5mg/ml)干预培养结膜FBs的荧光定量PCR结果：(1)对数生长期的大鼠结膜FBs中,VEGF164、VEGFR1、VEGFR2、TGF β2mRNA表达均显著增加,而TGF β1mRNA表达变化不明显且不受贝伐单抗影响。(2)2.5mg/ml贝伐单抗干预后48小时,各细胞因子的mRNA表达丰度均较对照组显著降低,其中以VEGF164(45%)和TGF β2(25%)抑制更为显著。6.S-D大鼠眼外滤过术后的滤过泡形态：接受滤过手术后,滤过泡在术后4天内保持弥散隆起形态,第6天滤过泡开始平伏。7.滤过术联合贝伐单抗结膜下注射后对滤过泡的影响及不良事件：贝伐单抗干预组(A1组)出现滤过泡平伏的例数为0例(发生例数少于两对照组),3级滤过泡例数多于两对照组,经Kruskal-WallisH检验显示三组间差异有统计学意义(p=0.032)；A1组滤过泡充血少于两对照组(p=0.003)。不良事件中,A1组前房出血少于两对照组(p=0.002)；A1组虹膜反应轻于两对照组(p=0.000)。8.经贝伐单抗干预后滤过泡内生长因子和受体的mRNA表达变化：贝伐单抗干预组(A1组)的滤过泡中,VEGF164、Flt-1、Flkl、TGFβ1和TGFβ2mRNA表达水平均较两对照组显著下调,组间差异有统计学意义(p<0.05)；单眼滤过手术联合PBS注射后(B组)的VEGF164mRNA在第1天增加,第2～5天达到峰值。A1组的VEGF164mRNA水平稳定维持在较低水平；Flt-1mRNA表达丰度延时增高；TGFβ1mRNA在对数生长期(3～5天)表达丰度较其它组显著降低；TGFβ2mRNA在各时点的表达丰度较其它组显著降低。TGFβ2mRNA整体表达丰度在上述基因中最高,且表达波动最大。9.经贝伐单抗干预后滤过泡内生长因子和受体的蛋白表达变化：在多个时点,贝伐单抗干预组(A1组)的VEGF-A蛋白(44KD)、TGF β1蛋白(25KD).TGF β2蛋白(48KD)的条带浓度均低于两对照组。[结论]1.S-D大鼠结膜成纤维细胞存在VEGF及其受体(VEGFR1、VEGFR2)拘表达以及炎症因子(TGFβ1、TGFβ2)的表达。2.贝伐单抗可明显抑制体外培养的对数生长期大鼠结膜成纤维细胞的生长,下调血管内皮生长因子和炎症因子的表达。3.滤过手术联合结膜下注射贝伐单抗后,可以更好地维持大鼠滤过泡功能,未见明显眼部不良反应。贝伐单抗可明显降低滤过泡内血管内皮生长因子和炎症因子的基因和蛋白表达。4.贝伐单抗抑制滤过泡瘢痕化的作用可能通过血管化(血管内皮细胞)途径和非血管化(成纤维细胞)途径共同完成。