论文部分内容阅读
乳腺癌是导致女性死亡的重要原因，治疗方式多为手术治疗，但手术治疗给女性未来的生活造成了诸多不便，所以大多数患者选择保乳治疗，包括放疗和化疗等。然而，化疗会给患者造成一定的副作用，为了提高化疗药物的疗效并降低其毒性，我们开发了一种以部分乙酰化聚酰胺胺为载体，黄体化激素释放激素为寻靶器的化疗药物/基因药物靶向共传递体系。该共传递体系能够将药物靶向递送到病灶位置增加药物的浓度并减少药物对正常组织和器官的毒副作用。
目的：成功制备表征LHRH-G5.0NHAC-FUA/miR-205纳米共传递靶向给药体系，并研究其体内外抗乳腺癌作用及其作用机理。
方法：1.LHRH-G5.0NHAC-FUA/miR-205纳米给药共传递体系的制备：第五代PAMAM表面氨基部分乙酰化后得到G5.0NHAC，剩下的氨基通过功能化PEG将LHRH偶合到G5.0NHAC表面，得到LHRH-G5.0NHAC，再将经溴乙酸修饰的5-氟尿嘧啶-1-乙酸(FUA)通过酰胺键键合到G5.0NHAC上，成功制备了LHRH-G5.0NHAC-FUA纳米靶向前药。之后将miR-205mimic与上述前药按不同的比例通过静电结合制备LHRH-G5.0NHAC-FUA/miR-205纳米给药共递送体系。
2.LHRH-G5.0NHAC-FUA/miR-205纳米共传递给药体系理化性质及其体外生物相容性的表征研究：通过紫外(UV)光谱和核磁(NMR)表征LHRH-G5.0NHAC-FUA/miR-205的光学特性以及化学结构；凝胶电泳和细胞转染实验确定LHRH-G5.0NHAC-FUA与miR-205的最佳质量比；通过纳米粒度仪表征LHRH-G5.0NHAC-FUA/miR-205的粒径分布和Zeta电位；紫外分光光度法测定LHRH-G5.0NHAC-FUA/miR-205的载药量及其在不同pH下的释药性能；溶血实验考察LHRH-G5.0NHAC-FUA/miR-205的血液相容性；MTT法考察LHRH-G5.0NHAC对正常细胞MCF-10A的毒性。
3.LHRH-G5.0NHAC-FUA/miR-205纳米共传递给药体系的体外抗肿瘤作用及其机制研究：显微荧光拍照评价LHRH-G5.0NHAC的体外靶向性；人乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231为体外抗肿瘤实验研究对象，通过MTT法表征LHRH-G5.0NHAC-FUA/miR-205的体外肿瘤细胞增殖抑制作用；利用划痕愈合实验评价LHRH-G5.0NHAC-FUA/miR-205抑制肿瘤细胞迁移的能力；采用Transwell实验观察LHRH-G5.0NHAC-FUA/miR-205抑制肿瘤细胞侵袭的能力；流式细胞仪检测LHRH-G5.0NHAC-FUA/miR-205对肿瘤细胞凋亡和周期的影响。
4.LHRH-G5.0NHAC-FUA/miR-205纳米给药共传递体系体内组织分布及其抗肿瘤作用研究：通过建立MCF-7乳腺癌荷瘤裸鼠实验动物模型，并对其随机分组腹腔注射给药，记录其体重、瘤体积的变化，给药21天后，解剖荷瘤裸鼠并取出肿瘤组织和心、肝、肾等主要器官，其中一部分用于组织切片HE染色然后观察其形态，评价LHRH-G5.0NHAC-FUA/miR-205对动物正常器官的毒副作用，另一部分肿瘤和器官组织切片经过VEGF-A抗体孵育染色进一步观察共传递体系的抗肿瘤效果；同时通过连续对正常SD大鼠给药7天后取血，通过全自动生化检测仪测定主要脏器相关指标参数用于评价LHRH-G5.0NHAC-FUA/miR-205毒副作用。
结果：LHRH-G5.0NHAC-FUA/miR-205纳米给药共传递体系中LHRH-G5.0NHAC-FUA的配料比为LHRH∶G5.0NHAC∶FUA=1.5∶1∶300，LHRH-G5.0NHAC-FUA与miR-205的最佳质量比为1024∶1。在最优合成条件下获得的LHRH-G5.0NHAC-FUA/miR-205纳米给药共传递体系载药量为40.76%(n=3)，平均粒径为238.40nm，Zeta电位为4.40mV；紫外和核磁结果表明成功合成LHRH-G5.0NHAC-FUA；药物释放性能结果表明LHRH-G5.0NHAC-FUA/miR-205具有良好的缓释效果；LHRH-G5.0NHAC-FUA/miR-205的溶血率在5%以下，说明其具有良好的血液相容性；荧光拍照结果显示LHRH-G5.0NHAC-FUA/miR-205对乳腺癌细胞具有良好的靶向性，竞争结合实验更是说明LHRH对乳腺癌细胞的靶向性；MTT法结果表明乙酰化后得到的G5.0NHAC的毒性明显小于G5.0PAMAM，且LHRH-G5.0NHAC-FUA/miR-205具有协同抑制乳腺肿瘤细胞增殖作用并存在时间和剂量依赖性；划痕愈合实验和Transwell实验结果表明LHRH-G5.0NHAC-FUA/miR-205具有协同抑制细胞迁移和侵袭的能力；体外的实验结果更进一步说明了LHRH-G5.0NHAC-FUA/miR-205较其他给药组具有更强的抗乳腺癌效果。体内外实验结果表明，LHRH-G5.0NHAC-FUA/miR-205在一定程度上减少了5-FU对主要脏器的毒副作用，并具有协同抗乳腺癌的作用。
结论：成功制备了靶向乳腺癌的LHRH-G5.0NHAC-FUA/miR-205纳米共传递给药体系，该体系生物相容性好、安全、缓释并且具有良好的体内外协同抗乳腺癌效果。
目的：成功制备表征LHRH-G5.0NHAC-FUA/miR-205纳米共传递靶向给药体系，并研究其体内外抗乳腺癌作用及其作用机理。
方法：1.LHRH-G5.0NHAC-FUA/miR-205纳米给药共传递体系的制备：第五代PAMAM表面氨基部分乙酰化后得到G5.0NHAC，剩下的氨基通过功能化PEG将LHRH偶合到G5.0NHAC表面，得到LHRH-G5.0NHAC，再将经溴乙酸修饰的5-氟尿嘧啶-1-乙酸(FUA)通过酰胺键键合到G5.0NHAC上，成功制备了LHRH-G5.0NHAC-FUA纳米靶向前药。之后将miR-205mimic与上述前药按不同的比例通过静电结合制备LHRH-G5.0NHAC-FUA/miR-205纳米给药共递送体系。
2.LHRH-G5.0NHAC-FUA/miR-205纳米共传递给药体系理化性质及其体外生物相容性的表征研究：通过紫外(UV)光谱和核磁(NMR)表征LHRH-G5.0NHAC-FUA/miR-205的光学特性以及化学结构；凝胶电泳和细胞转染实验确定LHRH-G5.0NHAC-FUA与miR-205的最佳质量比；通过纳米粒度仪表征LHRH-G5.0NHAC-FUA/miR-205的粒径分布和Zeta电位；紫外分光光度法测定LHRH-G5.0NHAC-FUA/miR-205的载药量及其在不同pH下的释药性能；溶血实验考察LHRH-G5.0NHAC-FUA/miR-205的血液相容性；MTT法考察LHRH-G5.0NHAC对正常细胞MCF-10A的毒性。
3.LHRH-G5.0NHAC-FUA/miR-205纳米共传递给药体系的体外抗肿瘤作用及其机制研究：显微荧光拍照评价LHRH-G5.0NHAC的体外靶向性；人乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231为体外抗肿瘤实验研究对象，通过MTT法表征LHRH-G5.0NHAC-FUA/miR-205的体外肿瘤细胞增殖抑制作用；利用划痕愈合实验评价LHRH-G5.0NHAC-FUA/miR-205抑制肿瘤细胞迁移的能力；采用Transwell实验观察LHRH-G5.0NHAC-FUA/miR-205抑制肿瘤细胞侵袭的能力；流式细胞仪检测LHRH-G5.0NHAC-FUA/miR-205对肿瘤细胞凋亡和周期的影响。
4.LHRH-G5.0NHAC-FUA/miR-205纳米给药共传递体系体内组织分布及其抗肿瘤作用研究：通过建立MCF-7乳腺癌荷瘤裸鼠实验动物模型，并对其随机分组腹腔注射给药，记录其体重、瘤体积的变化，给药21天后，解剖荷瘤裸鼠并取出肿瘤组织和心、肝、肾等主要器官，其中一部分用于组织切片HE染色然后观察其形态，评价LHRH-G5.0NHAC-FUA/miR-205对动物正常器官的毒副作用，另一部分肿瘤和器官组织切片经过VEGF-A抗体孵育染色进一步观察共传递体系的抗肿瘤效果；同时通过连续对正常SD大鼠给药7天后取血，通过全自动生化检测仪测定主要脏器相关指标参数用于评价LHRH-G5.0NHAC-FUA/miR-205毒副作用。
结果：LHRH-G5.0NHAC-FUA/miR-205纳米给药共传递体系中LHRH-G5.0NHAC-FUA的配料比为LHRH∶G5.0NHAC∶FUA=1.5∶1∶300，LHRH-G5.0NHAC-FUA与miR-205的最佳质量比为1024∶1。在最优合成条件下获得的LHRH-G5.0NHAC-FUA/miR-205纳米给药共传递体系载药量为40.76%(n=3)，平均粒径为238.40nm，Zeta电位为4.40mV；紫外和核磁结果表明成功合成LHRH-G5.0NHAC-FUA；药物释放性能结果表明LHRH-G5.0NHAC-FUA/miR-205具有良好的缓释效果；LHRH-G5.0NHAC-FUA/miR-205的溶血率在5%以下，说明其具有良好的血液相容性；荧光拍照结果显示LHRH-G5.0NHAC-FUA/miR-205对乳腺癌细胞具有良好的靶向性，竞争结合实验更是说明LHRH对乳腺癌细胞的靶向性；MTT法结果表明乙酰化后得到的G5.0NHAC的毒性明显小于G5.0PAMAM，且LHRH-G5.0NHAC-FUA/miR-205具有协同抑制乳腺肿瘤细胞增殖作用并存在时间和剂量依赖性；划痕愈合实验和Transwell实验结果表明LHRH-G5.0NHAC-FUA/miR-205具有协同抑制细胞迁移和侵袭的能力；体外的实验结果更进一步说明了LHRH-G5.0NHAC-FUA/miR-205较其他给药组具有更强的抗乳腺癌效果。体内外实验结果表明，LHRH-G5.0NHAC-FUA/miR-205在一定程度上减少了5-FU对主要脏器的毒副作用，并具有协同抗乳腺癌的作用。
结论：成功制备了靶向乳腺癌的LHRH-G5.0NHAC-FUA/miR-205纳米共传递给药体系，该体系生物相容性好、安全、缓释并且具有良好的体内外协同抗乳腺癌效果。