目的:肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是世界范围内死亡率较高的恶性肿瘤之一,且其发病率高约占全部原发性肝癌病例的70%～85%。HCC主要的治疗方案包括手术治疗、放射治疗和药物治疗,其中手术治疗是首选方案。但是由于HCC病程早期无明显症状,50%以上患者诊断时已超出手术最佳时期。因此靶向药物治疗、介入治疗、放射治疗在更好的控制和治疗HCC中也十分重要。HCC的发生经历了细胞内信号通路的改变、肿瘤增殖代谢系统的改变以及局部肿瘤微环境的形成等极其复杂的多个过程。基于HCC发生和发展中基因表达谱的变化以及细胞内信号通路的改变等进行研究,可以筛选出潜在的治疗新靶点。而利用筛选得到的HCC治疗靶点的蛋白晶体结构,就可以进行靶向药物的设计。利用药物受体学说,可以基于靶点蛋白或其配体的3D结构设计出相应的靶向药物。以配体的肽模拟物为先导物,利用计算机模拟设计技术对其进行合理的结构改造,可以获得与特定蛋白亲和的多肽偶联药物。对此多肽偶联药物进行合成路线设计后,通过化学合成即可获得目标肽类化合物。本研究旨在筛选HCC潜在的治疗靶点,并进一步设计能与此靶点结合的靶向肽偶联药物,主要分为以下两部分研究内容:(1)基于生物信息大数据分析筛选HCC治疗新靶点:对HCC差异表达基因进行数据分析并结合临床病理参数相关性研究,筛选得到候选靶点CTAG2和PRSS3;(2)靶向PRSS3的多肽偶联药物设计及活性研究:基于PRSS3的3D空间结构进行计算机辅助药物设计得到靶向肽WZ-1。设计多肽WZ-1偶联苯丁酸氮芥的合成路线,通过化学合成获得靶向PRSS3的多肽偶联药物。研究方法:1、肝癌转录组数据的获取及差异基因筛选:本研究所用的RNA-Seq数据和相应临床数据从TCGA数据库中下载,包括374例HCC样本和50例癌旁配对样本。从Bioconductor下载的EdgerR用于筛选差异表达基因。分析TCGA数据库中肝癌组织和癌旁组织中差异表达的RNA,然后利用R语言对差异表达基因进行可视化展示,绘制火山图和热图。2、蛋白-蛋白相互作用网络构建:通过STRING数据库分析差异基因,构建蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络,获得相应的TSV文件;利用cytoscaper软件进行网络分析,将TSV文件导入,设置起源节点和目标节点后,再通过四种拓扑分析法:MCC、DMNC、MNC、degree分别构建子网络,得到候选靶点基因CTAG2、NTS、GNG4、GAST、PRSS1和PRSS3。3、候选靶点基因表达与临床病理参数相关性分析:利用TCGA数据库分析候选靶点基因表达与不良预后及其它临床病例参数的相关性,并利用免疫组织化学染色检测CTAG2在肝癌患者肿瘤组织和癌旁组织的表达情况。4、基因集富集分析:利用GSEA网站MsigDB数据库中获得的c2.cp.kegg.v6.1.symbols.gmt数据集,对根据CTAG2/PRSS3的表达分组的TCGA LIHC中患者肿瘤组织中RNA-seq数据进行缺省加权富集统计分析。富集结果主要参数具有显著性意义的标准设为NES>1.5,P<0.05。5、计算机辅助药物分子设计:基于候选靶点PRSS3的3D空间结构,利用MOE软件自动识别配体与PRSS3的结合位点,并确定其中的关键锚点。再通过多肽构象优化、分子对接和结合能量分析等进行合理药物设计。6、Fmoc固相合成法:以不溶性固体树脂作为载体,利用SPPS法从C端合成至N端得到靶向PRSS3的多肽。使用Fmoc保护Thr、Gly、Pro、Cys、Arg、Leu、Asp、Ile的氨基部分,利用Fmoc在弱碱性条件下易脱除的特性进行肽类的延长。再以Fmoc-e-Acp-OH为原料,通过线性合成方式在多肽序列上继续进行缩合反应,然后再与苯丁酸氮芥反应生成终产物。最后使用树脂裂解液处理后得到靶向PRSS3的多肽WZ-1偶联苯丁酸氮芥。7、RP-HPLC含量测定方法:多肽WZ-1偶联苯丁酸氮芥采用RP-HPLC法进行含量测定,对样品溶液进行线性关系考察、精密度考察和稳定性研究。8、细胞毒性检测:采用MTT实验检测多肽WZ-1偶联苯丁酸氮芥对肿瘤细胞的杀伤作用。9、数据统计分析:生存分析采用Kaplan-Meier曲线(log-rank检验),非正态分布数据采用Mann-Whitney U检验进行差异比较。Cox回归分析采用单变量和多变量分析。采用Wilcoxon秩和检验对免疫组化数据进行分析。CTAG2和PRSS3表达水平与HCC临床病理参数的相关性研究,采用Pearson Chi-square(χ~2)test或Fisher精确检验进行分析。统计检验均采用SPSS软件16.0版(SPSS,Inc.,Chicago,IL,USA)完成。所有分析均以P<0.05为差异具有统计学意义的标准。结果:1、基于生物信息大数据分析筛选肝细胞肝癌治疗新靶点(1)差异基因的数据分析及候选靶点基因的确定:筛选TCGA数据库中肝癌患者肿瘤组织与癌旁组织的差异表达基因(DEGs),得到显著上调DEGs共4750个。然后进行分子功能分析,结果表明这些DEGs与转录调控和转录辅抑制因子活性密切相关。构建的PPI网络并分析,结果提示CTAG2、NTS、GNG4、GAST、PRSS1和PRSS3可以作为候选靶点基因进行下一步研究。(2)CTAG2和PRSS3在肝癌组织中的表达与临床病理参数相关性分析:TCGA数据库中6个候选靶点基因在肝癌组织中的表达值均显著高于癌旁组织。基于单变量Cox回归分析结果,TNM分期(P<0.001),AFP高表达(P=0.010)和CTAG2高表达(P=0.035)与患者的预后显著相关,提示CTAG2高表达组患者总体生存期显著缩短。此外CTAG2表达与年龄(P=0.003)、T分期(P=0.028)、TNM分期(P=0.028)和AFP(P=0.045)表达显著相关。PRSS3表达与诊断年龄(P=0.012)显著相关,但与性别、T分期、TNM分期和AFP表达等参数无相关性。结合候选靶点基因的肿瘤表达谱情况,我们将CTAG2和PRSS3视为重要的潜在肝癌的治疗靶点。(3)CTAG2和PRSS3相关KEGG信号通路分析:采用GSEA富集分析相关KEGG信号通路,CTAG2高表达样本富集到同源重组、细胞周期、DNA复制、碱基切除修复、磷酸戊糖途径、错配修复、核苷酸切除修复等KEGG信号通路;而PRSS3高表达组被显著富集到DNA复制、细胞周期、Ig A生成的肠免疫网络、错配修复、细胞因子受体相互作用等信号通路。结果提示CTAG2和PRSS3的相关KEGG信号通路可能与肿瘤细胞异常增殖有关。2、靶向PRSS3的多肽偶联药物设计及活性研究(1)PRSS3与其蛋白抑制剂相互作用关键锚点的确定:使用MOE对PRSS3及抑制剂的蛋白复合物结构进行结构细化,并确定抑制剂与PRSS3的相互作用位点。分析结果显示蛋白抑制剂的Pro13、Cys14,Arg15,Asp17残基为相互作用的关键锚点,即抑制剂通过这些氨基酸以氢键及氢键-离子键的作用嵌入到PRSS3的结合口袋中。(2)PRSS3靶向肽的设计与分子对接:以PRSS3抑制剂与受体的关键结合位点所在的多肽片段为多肽序列的模板(TGPCRADI),并依此设计了18条含有8个氨基酸的多肽序列。使用MOE将设计的多肽与PRSS3受体进行对接,结果显示所设计的多肽其中6条模拟计算的结合情况显著优于模板肽序列(S score<-40)。其中多肽WZ-1可以较好的嵌入PRSS3的结合口袋且S分值最低,所以选定此多肽序列进行合成。(3)多肽WZ-1偶联药物的合成路线设计:选用Fmoc合成策略,以树脂与Ile的羧基以共价键进行连接。然后与Asp的羧基进行缩合反应,依照去保护基、缩合、洗涤、再去保护的循环过程进行肽链的延长。缩合反应采用的是活性酯法并以HOAt和DIC为偶联剂组合。最后以线性合成方式将linker和苯丁酸氮芥与多肽WZ-1连接得到多肽偶联药物。(4)多肽WZ-1偶联药物的合成:我们选用Wang树脂作为固相反应中的载体,同时确定了氨基酸与树脂投料比为4:1。以Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH和Fmoc-Thr(tBu)-OH等含保护基的氨基酸为原料合成多肽WZ-1偶联苯丁酸氮芥。使用MS进行结构确证,并经分析液相检测纯度为96.77%。(5)多肽WZ-1偶联苯丁酸氮芥含量方法学验证:多肽WZ-1偶联苯丁酸氮芥供试品溶液在室温48小时内稳定;以样品浓度对峰面积进行线性回归,试验结果表明样品峰面积与浓度(0.50～1.5mg/ml)范围间线性关系良好,线性回归方程为:y=8680x+109.29,相关系数r为0.9996;此含量分析方法重复性和中间精密度良好。(6)多肽WZ-1偶联苯丁酸氮芥的细胞毒性效果:MTT实验结果显示多肽WZ-1偶联苯丁酸氮芥对肝癌细胞株具有细胞毒性作用。结论:1、数据挖掘结合临床病理参数相关性研究等组合分析后,筛选得到2个候选靶点基因CTAG2和PRSS3。2、CTAG2在肝癌组织中高表达且与肝癌不良预后密切相关,但目前无可获得的CTAG2蛋白3D结构。PRSS3在肝癌组织中高表达,GSEA分析的相关KEGG信号通路与肿瘤增殖有关。3、多肽WZ-1通过虚拟计算显示以Pro、Cys、Arg等关键锚点与PRSS3的3D空间结构进行结合。4、多肽WZ-1偶联苯丁酸氮芥是以多肽WZ-1为靶向部位的PDC类化合物。5、合成的多肽WZ-1偶联苯丁酸氮芥对肝癌细胞系具有细胞毒性作用,可以作为新型抗肿瘤靶向药物候选物。