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百草枯(1,1-二甲基-4,4二氯联吡啶化合物,paraquat,PQ)是全球使用最广泛的灭生性除草剂之一,用于多种作物中杂草的控制。光照条件下,百草枯施药后能立刻渗入叶片,诱导产生大量活性氧(reactive oxygen species,ROS),使植物绿色部位发生枯萎。百草枯投入使用近50年,极大促进了免耕农业的发展,但长期和大面积的使用造成了杂草抗药性的问题。近年来百草枯抗性在杂草和模式植物拟南芥和烟草中的研究表明抗百草枯机理主要有两种:1.百草枯被阻隔在叶绿体靶位点之外;2.植物清除活性氧能力增强。本研究以拟南芥为实验材料,鉴定了新的抗PQ突变体,并对AT1G31830/PQR2的功能进行了初步探讨。主要结果如下:1.抗PQ突变体的鉴定利用PQ筛选XVE诱导性标记激活突变体库的拟南芥材料,共得到8个拟南芥抗百草枯突变体,编号pqr1~8。正常培养条件下,8个突变体均能正常生长发育结实,与野生型并无明显差异。利用载体引物检测突变体发现pqr1、pqr3、pqr5、pqr6、pqr7检测到载体骨架,pqr2、pqr4、pqr8无T-DNA插入;此外T-DNA带有卡那霉素抗性筛选标记,但pqr2不具有卡那霉素抗性,由此推测抗PQ突变体pqr2的抗PQ表型不是由T-DNA插入引起的。随后对突变体pqr2的表型进行进一步考察,NBT染色结果显示,经PQ处理之后pqr2叶片中超氧化物积累量显著少于野生型;采用Evans Blue染色检测死亡细胞数量,发现PQ处理之后pqr2叶片细胞死亡程度显著低于野生型。以上结果说明在突变体pqr2中,经PQ处理诱导产生ROS,并最终导致细胞死亡的过程受到了抑制。2.pqr2中图位克隆抗百草枯基因利用图位克隆技术在pqr2中定位到抗百草枯基因PQR2,测序结果显示,pqr2的PQR2在CDS 453bp处T突变为A,导致编码的151位酪氨酸变成终止子,该位点在植物中非常保守。以PQR2 CDS全长连35S启动子构建了互补载体,突变体pqr2转入正常PQR2基因后,恢复野生型表型,即对PQ敏感。由此证实了pqr2的抗PQ表型是PQR2突变引起的。3.PQR2基因功能初步验证根据TAIR网站上AT1G31830/PQR2的注释,PQR2编码多胺转运体。本试验用不同浓度的腐胺(600μM和700μM)处理野生型和突变体pqr2,结果表明,pqr2根长比野生型显著变短,说明PQR2蛋白可能参与了多胺的转运。4.ABA抑制拟南芥对PQ的抗性本试验采用ABA和ABA合成抑制剂Na2WO4处理野生型和pqr2,结果显示ABA处理后,pqr2对PQ的耐受性显著下降;Na2WO4处理后,野生型对PQ的耐受性显著上升。RT-PCR分析PQ、ABA、Na2WO4处理条件下PQR2在野生型和pqr2中的表达量,发现ABA对PQR2表达有明显上调作用,而ABA合成抑制剂Na2WO4显著下调PQR2表达;此外ABA和Na2WO4处理条件下,pqr2中PQR2表达量显著低于野生型。以上结果说明ABA对拟南芥PQ抗性的抑制可能是通过上调多胺转运体基因PQR2的表达量,从而提高拟南芥细胞内PQ的转运效率引起的。5.pqr2中基因表达量的变化PQ诱导产生大量ROS,对植物造成氧化胁迫,影响相关基因的表达。本试验选取了21个受PQ调控表达的基因,RT-PCR分析PQ、ABA和Na2WO4处理后这些基因在野生型和pqr2中的表达量,结果发现,有9个基因在pqr2中的表达量相比野生型显著降低,包括蛋白激酶基因:AT5G07180和AT3G46370,ROS合成基因:AT3G11180和AT1G31690,参与植物保护途径和逆境响应的基因:AT1G77120、AT4G37930、AT3G52960、AT5G01600,转录因子:AT1G75390。以上结果说明PQR2能够直接或者通过ABA信号传导途径间接抑制这些基因的表达。