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目的:HIV-1的高突变性使得感染者的HIV-1病毒基因序列常常发生变异,而HIV-1分子传播网络分析根据感染者HIV-1病毒基因序列中的差异,将一条序列作为一个节点,两个节点之间距离越小说明二者之间在HIV感染中存在的关联越大,由此构建一个传播网络以分析潜在传播关系。由于HIV/AIDS传播途径的特殊性,通过调查可能不能反映其真实的传播,通过HIV的基因型和构建分子网络,以便客观的反映HIV/AIDS的传播。因此,在前期研究基础上扩大样本量,研究甘肃省HIV-1基因型和分布,构建甘肃省HIV-1分子传播网络,探索甘肃省HIV-1/AIDS潜在传播关系,对感染者在分子传播网络中的位置进行初步评估,追踪高风险传播样本,为甘肃省HIV-1/AIDS防治提供参考。同时,本研究基于甘肃省HIV-1基因型结果,构建甘肃省HIV-1主要流行的CRF01-AE、CRF07-BC、CRF55-01B和CRF65-cpx基因型的假病毒,为HIV-1的中和性抗体、病毒的免疫反应和耐药等相关研究奠定基础。方法:1.纳入样本:甘肃省疾控中心（CDC）2018年7月-2018年12月留存HIV确证试验阳性且病毒载量≥1000（拷贝数/ml）的血浆。每份样本均有甘肃省CDC与患者签署的知情同意书和保密协议。2.提取病毒RNA,用巢式RT-PCR扩增HIV-1 gag、pol和env,并将扩增产物送华大公司测序;拼接测序结果,用美国Los Alamos国家实验室HIV序列数据库的HIV-BLAST确定HIV-1基因型;将本研究中所获得的基因序列与本研究团队所测的基因序列,在MEGA 4.1版软件中,用Kimura’s 2-parameter方法计算基因距离,用Neighbor-joining法构建系统进化树;分子传播网络的构建通过将上述所有序列导入HYPHY2.2.4软件中,选择TN93核苷酸替代模型计算基因距离,确定最适基因距离阈值后,将基因距离小于阈值的数据挑选出来,利用Cytoscape3.2软件将数据进行可视化,构建分子传播网络。3.从以上样本中HIV-1基因分型为CRF01-AE、CRF07-BC、CRF55-01B、CRF65-cpx的血浆中提取RNA,用巢式RT-PCR扩增HIV-1全长env基因,经HindⅢ和BamHⅠ双酶切克隆至真核表达载体pEGFP-N1,构建包膜质粒pEGFP-N1-env;将成功构建以上基因型的包膜质粒pEGFP-N1-env和骨架质粒pNL4-3.Luc.R-E-按照1:4（μg）共转染至HEK-293T细胞,培养36h,用荧光显微镜观察EGFP的荧光表达情况,再继续培养12h,收集培养上清液,2500rpm离心10min,收集上清获得假病毒,培养皿中剩余的细胞进行裂解、收蛋白,用蛋白免疫印迹（Western Blot,WB）检测gp120的表达;将收获的假病毒感染U87细胞进行感染性及病毒滴度测定,通过荧光素酶检测试剂盒检测相对荧光值计算TCID50,检测值大于对照孔3倍判定为具有感染活性的假病毒。结果:1.选取2018年6月-2018年12月甘肃省CDC保留的106份HIV-1阳性样本,其中有82份样本成功扩增,74份样本鉴定基因型,主要以CRF07BC（56.8%,42/74）为主,其次为CRF01AE（31.1%,23/74）,B/B’亚型（4.1%,3/74）,CRF5501B（4.1%,3/74）,CRF08BC（2.7%,2/74）和CRF65cpx（1.4%,1/74）,有8份样本由于gag、pol和env基因型结果不一致,目前无法判断其基因型需进一步进行全长测序以确定其基因型;gag、pol、env基因的系统进化树特征相似,同一个基因型的序列分散在国际参考株两侧;甘肃省HIV-1分子传播网络中一共形成8个传播簇,节点和传播簇较少,复杂程度低,且度为1和2的样本比较多,样本GS-141的度最高,为高传播风险样本。2.通过双酶切鉴定、PCR鉴定以及测序结果均表明:各基因型的HIV-1包膜质粒pEGFP-N1-env构建成功;通过各基因型包膜质粒pEGFP-N1-env和骨架质粒pNL4-3.luc.E-R-共转染后收获的假病毒测得相对荧光值大于3倍对照孔的相对荧光值,显微镜下均观察到EGFP绿色荧光蛋白表达,WB检测gp120蛋白表达量较低,HIV-1假病毒构建成功且具有感染性。结论:1.甘肃省HIV-1基因型分布情况与西北地区整体分布情况相似,以CRF07BC所占比例最多,其次是CRF01AE;甘肃省HIV-1基因型流行趋势与中国整体流行趋势相似,CRF01AE所占比例在甘肃省的感染人群中逐步增多;鉴于本研究获得的样本量,甘肃省HIV-1感染者以小簇传播为主,传播情况相对简单但存在高传播风险的感染者,需要再扩大样本量进一步并深入研究。2.成功构建HIV-1基因型CRF01-AE、CRF07-BC、CRF55-01B和CRF65-cpx的假病毒。