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戊型肝炎(Hepatitis E,HE)是一种经消化道传播的急性病毒性肝炎,呈全球分布,以暴发流行或散发感染的形式存在。戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus,HEV)是其病原体,为一无包膜的单股正链RNA病毒,基因组全长约7.2kb,含有3个开放读码框架(Open Reading Frames,ORFs):ORF1,ORF2和ORF3。根据全基因序列的差异,可将HEV分为4个基因型,以缅甸株为代表的第1基因型、以墨西哥株为代表的第2基因型、以美国株为代表的第3基因型和以新中国株为代表的第4基因型,各基因型又可分为若干基因亚型。
HEV基因分型对HEV的生物学特性研究、流行病学调查以及疫苗研发等均有重要意义。根据全基因序列进行基因分型,由于采用了全部的基因信息,因此最为准确。但由于全基因组测序费时费力,故国内外研究者大多选取HEV部分基因序列替代全基因组进行基因分型。目前,由于不同实验室用于基因分型的序列的长度、位置不同,致使HEV分型不统一,分型结果也难以互相比较,影响了HEV基因分型的可靠性和可信度。针对HEV基因分型的现状,本研究通过设计HEV通用性PCR引物,逆转录-套式聚合酶链反应(RT-nPCR)扩增不同基因型HEV可测序长片段,提高HEV基因分型的可靠性和可信度,进一步探索统一HEV基因分型标准的可能性。本研究内容主要包括以下两部分：
一、HEV通用性PCR引物的设计及其基因分型的研究
Meng等曾于1997年设计了一套HEV通用性PCR引物(MXJ引物),该套引物所扩增的5994～6294nt区段被广泛用于HEV基因分型,且该区段后来被证实在目前5个常用的HEV基因分型区段中其与全基因组的分型结果最为相近,但该套引物与现有的HEV序列出现了不匹配。针对HEV基因分型的现状,我们在MXJ引物的基础上,通过分析GenBank中现有的82株HEV基因组全序列,于ORF2的近5端共同保守区域重新设计了一套HEV通用性套式PCR引物(HEVuPrimer),扩增5704～6297nt区段用于HEV基因分型。本研究比较了HEVuPrimer和MXJ引物与82株HEV序列的匹配情况,结果表明HEVuPrimer与HEV序列的匹配程度明显高于MXJ引物。分别基于全基因组序列、HEVuPrimer扩增区段和MXJ引物扩增区段对82株HEV构建系统进化树进行基因分型,HEVuPrimer扩增区段与全基因组基因分型结果完全一致,HEVuPrimer区段的分型结果较MXJ区段更为准确,而且基于前者构建的系统进化树在自举值>75％范围内的分支的数量也多于后者,表明HEVuPrimer区段可以较好地代表全基因序列进行HEV基因分型,且HEVuPrimer比MXJ引物具有更好的应用价值。用HEVuPrimer系统测试了不同基因型的HEV参考毒株,结果在预期大小片段位置(644bp)获得特异性扩增条带,测序后所得序列与GenBank原序列完全一致,验证了其在实际工作中可扩增出不同变异程度的HEV基因片段,有助于发现新的HEV变异毒株。
二、南京地区散发性HE流行病学调查及病毒基因型分析
为了解南京地区散发性脏的流行病学特点,本研究对2006年及2007年南京市第二医院收治的316例散发性HE患者的发病情况进行了调查分析。发现散发性HE发病具有明显季节性,316例患者中,发病人数最多是在春季(3月～5月),为142人,占病例总数的44.9％,形成一个较明显的发病高峰；其次为冬季(12月～2月),为75人：夏季(6月～8月),为60人：秋季(9月～11月)发病人数相对最少,为39人。HE患者在性别、年龄分布亦有差别,男女之比约为2.4:1,发病高峰年龄在40岁～59岁之间,占全部病例的44.3％,发病率显著高于其他年龄组。
将HEVuPrimer用于检测在南京地区收集的124份HEV IgM抗体阳性的临床血清标本,60份检测出特异性HEV RNA,PCR阳性率为48.4％,测序后与GenBank中1～4基因型HEV的序列同源列队两端对齐后构建进化树,并结合核苷酸同源性分析进行基因分型。60例阳性标本毒株均为4型HEV,且分属于4个不同的基因亚型,核苷酸同源性为80.0％～99.9％。06年的样本毒株分为3个基因亚型,07年则增加为4个基因亚型,并且出现了新的基因亚型,提示我国HEV基因变异在不断增大且呈逐年增高的趋势。结合以往的研究结果,我们认为,从1986年到2007年,我国的HEV基因型的流行特征经历了从1型为主到1型和4型共存,再到以4型为主的变化过程,且我国4型HEV基因亚型的分布呈复杂性的特征。
总之,要统一HEV基因分型的标准,其前提是统一用于HEV基因分型的PCR扩增和测序片段。该区段应具备三个基本条件：①该区段存在一定变异程度,可以替代全基因序列进行基因分型；②该区段侧翼序列保守,易于设计PCR引物用于不同变异程度的HEV扩增,且设计的引物能够在实际工作中同时扩增出不同基因型HEV毒株的基因片段；③该区段的核苷酸序列应达到一定的长度,以使基于遗传距离所构建的系统进化树具有较好的可信度。我们根据上述条件所设计的HEVuPrimer可以全面准确地检测各型HEV,基于其扩增区段的HEV基因分型方法具有较高的可靠性和可信度,为建立统一、可行的HEV基因分型标准提供了新的思路。