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氢能被认为是未来最理想的能源之一。生物制氢因具有可持续、条件温和、环境友好,且可与污染物处理相偶联等优点,而越来越受到人们的重视。然而,截至目前生物制氢的研究尚未取得突破性进展,工程菌的产氢效率远未达到产业化的要求。因此,阐明生物产氢机理、提高产氢效率仍是生物制氢亟待解决的重要科学问题。本研究以一株野生型产气肠杆菌(Enterbacter aerogenes) CCTCC AB91102为出发菌株,该菌为兼性厌氧菌,且分子生物学操作便利,生长速率高,在理想条件下具有最高的理论产氢效率(10mol H2/mol葡萄糖),产氢能力提升空间大。为提高E.aerogenes的产氢能力,并明晰其产氢机理,分别或同时敲除了吸氢酶基因和产氢竞争途径中关键酶基因,在此基础上,通过过表达NAD合成酶,研究了细胞中NAD水平对产氢代谢中碳流分配的影响。同时,为使得到的高效产氢工程菌能够运用到实际生产中,还对可再生废弃物的预处理方法进行了探索,以微藻水解产物为底物,高效工程菌为生产菌株,进行了厌氧批次产氢发酵实验,优化了发酵参数。主要研究内容和结果摘要如下。1.敲除竞争途径关键酶基因ldh和ppc对产气肠杆菌产氢的影响。乳酸和琥珀酸是E.aerogenes CCTCC AB91102除产氢外最主要的糖酵解产物。本研究从该菌基因组DNA中克隆得到编码产乳酸途径关键酶乳酸脱氢酶(LDH)的基因ldh和产琥珀酸途径关键酶编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)的基因ppc。利用这两个基因的PCR产物在Red重组系统的介导下与基因组中的基因进行同源重组。经PCR验证、抗性验证和代谢产物分析,表明目标基因已从基因组中完全敲除。所得到的三个突变菌株中AB91102-L (△ldh)和AB91102-P (△ppc)产氢效率相对野生菌分别提高了12.4%和32.2%,产氢量分别降低4.5%和6.1%,AB91102-L产乳酸途径被阻断,AB91102-P产琥珀酸降低94.6%。双基因敲除菌株AB91102-LP(△ldh, △ppc)生长缓慢,产氢量显著降低。2.敲除吸氢途径关键酶小亚基基因hybO对产气肠杆菌产氢的影响。从E.aerogenes基因组中克隆得到hybO基因后,其PCR产物通过Red重组系统介导与野生菌、AB91102-L和AB91102-P分别进行同源重组得到三个突变菌株AB91102-O(△HybO)、AB91102-OL (△hybO/Aldh)和AB91102-OP (△hybO/△ppc),其中突变菌株AB91102-O和AB91102-OP的产氢效率相对野生菌分别提高24.0%和68.8%,产氢量相对野生菌分别增加21.3%和27.6%。AB91102-OP产氢能力的显著增长表明,减少氢气消耗和阻断竞争代谢途径是提高产氢的有效策略,同时存在某种程度的协同效应。3.过表达NAD合成酶促进产气肠杆菌及其突变菌产氢的研究。从AB91102基因组中克隆得到编码NAD合成酶的基因nadE。通过对pET-28(+)质粒进行改造,获得能够在E. aerogenes中表达外源蛋白的质粒pET28kan。构建pET28kan-nadE,转入AB91102野性型和多株突变体中,SDS-PAGE和Western-Blot实验证明NAD合成酶内源表达成功,获得两个突变菌株AB91102-O/N(△HybO/nadE)、 AB91102-OP/N(AhybO/△ppc/nadE)和一个对照菌株AB91102-OC。厌氧恒化实验结果表明,AB91102-ON和AB91102-OP/N的NADH/NAD+总浓度较对照菌分别增加了91.2%和109.7%,但NADH/NAD+比值则分别从1.11下降到0.83和0.94.AB91102-ON的产氢效率和产氢量分别增长了66.0%和165.8%, AB91102-OP/N则分别增长了149.5%和301.1%,AB91102-OP/N的最高产氢量达到了5.1L/L。通过分析代谢终产物浓度、产氢直接相关的NADH利用率(NADH)uH/Glu(该概念为本文首次提出)以及ADH、LDH和BDDH等酶活的变化,结果表明：降低氢气消耗、提高NADH的利用率和提高NAD的总浓度三种策略对促进产氢的协同效应明显。4.预处理“微藻提脂残留物”(LMBRs)的方法研究。利用“脂肪酶发酵酵母残余物”(LYBRs)自溶产物中存在的蛋白酶,在48℃下催化处理LMBRs 24 h,使LMBRs中总氮含量降低了45.0%。将处理和未处理过的样品进行热碱法水解,得出在100℃下处理过的LMBRs产还原糖和可溶性总氮的量均最高,分别为189.3 mg/gLBMRs和36.56 mg/g LBMRs,其中氨基酸含量为102.8 mg/g LBMRs;未用自溶产物处理过的LMBRs水解产生的还原糖仅为该产量的87.1%。说明以酵母自溶物预处理再进行热碱水解是一种简单有效的LMBRs处理方法。5.优化以LMBRs水解产物为底物产氢发酵条件。采用中心组合设计,通过三次平行实验取得的数值,拟合得到反应温度、接种量和pH值与产氢量之间关系的多元二次回归模型。方差分析(ANOVA)结果显示,该模型的显著性和可靠性较高,拟合效果良好。该模型预测出的最佳产氢结果为54.22 mL/g LMBRs,产氢条件为温度37.55℃,接种量12.25%,pH值5.95。进行了厌氧批次发酵产氢验证实验,实际结果为54.61 mL/g LMBRs,与预测值十分接近,说明该模型能较好反映三因素对产氢量的影响。