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为了初步探索荧光假单胞菌蛋白酶(Pseudomonas Fluorescens Protease,PFP)水解牛乳的特性以及水解物的免疫活性,先就PFP对牛乳中主要蛋白质的水解特性进行了试验研究,确定了水解的最佳条件,并在此基础上,进一步研究了牛乳的PFP水解物对小鼠免疫功能的影响。本试验研究包括以下三个部分:1.PFP酶学性质的初步研究:对PFP的含量、活性、酶的最适温度及pH值进行了研究。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE)确定了经过盐析、超滤、离子交换层析、疏水层析和凝胶层析后的蛋白酶达到了电泳纯;通过考马斯亮蓝法测定酶的含量;通过偶氮酪蛋白法测定酶的活性及酶的最佳温度与pH值。结果表明:得到的PFP为电泳纯蛋白酶;酶的含量为62.37μg/mL;酶的活性为17333 U/mL;酶的最佳温度为40℃,最佳pH值为7.5。2.PFP水解牛乳蛋白特性的研究:就PFP对牛乳中主要六种蛋白质的水解特性进行了试验研究,确定了形成免疫活性肽的最佳条件。PFP水解牛乳中六种蛋白质后形成的水解物分别用SDS-PAGE和反相高效液相色谱(Reverse phase-highperformance liquid chromatograph,RP-HPLC)法检测,通过正交试验优化了水解工艺参数。结果表明:α_s-CN、β-CN、κ-CN均在PFP作用下得以水解,而BSA、α-la、β-lg三种乳清蛋白均未被水解。以RP-HPLC方法对PFP水解酪蛋白形成的免疫活性肽的测定,在通过210 nm处检测最大吸收峰面积得出最佳水解工艺参数:水解时间为3 h、水解pH 6.5、水解温度40℃、蛋白酶与底物浓度比为1:200(v/v)。3.PFP水解脱脂乳粉产物免疫活性的研究:试验研究了脱脂乳粉的PFP水解物对小鼠免疫功能的影响。受试小鼠分别灌喂生理盐水、低剂量(100 mg/Kg.bw)及高剂量(250 mg/Kg.bw)PFP水解脱脂乳粉形成的水解产物,30 d后测定小鼠免疫活性指标,就水解物对小鼠免疫功能的影响进行了试验研究。结果显示:高、低剂量饲喂对小鼠生长均无显著影响;低剂量饲喂可增强脾脏指数(P＜0.05),而对胸腺指数影响不明显;高剂量饲喂可增强单核巨噬细胞吞噬功能(P＜0.05);低剂量饲喂24 h及高剂量饲喂48 h均显著提高小鼠迟发型变态反应(P＜0.05),而低剂量饲喂48 h及高剂量饲喂24 h小鼠迟发型变态反应及抗体细胞生成能力均有极显著的增强作用(P＜0.01);表明脱脂乳粉的PFP水解物可以提高小鼠免疫功能。通过完成三个部分的试验研究,可以得出PFP是一种对热有一定的耐受性的蛋白酶,该蛋白酶可水解牛乳中的酪蛋白,但不水解乳清蛋白,且水解物均含有免疫活性肽。PFP对酪蛋白酶解形成免疫活性肽的水解时间为3 h、水解PH 6.5、水解温度40℃,酶与底物浓度比为1:200(v/v);PFP水解脱脂乳粉物可以促进小鼠免疫器官的发育、刺激吞噬细胞的吞噬功能、增强迟发性变态反应以及增加抗体的生成数,因此可以提高小鼠免疫功能。本研究对PFP的合理利用提供了一条新的思路,同时为免疫活性肽的形成提供一条可行的技术思路,并丰富了牛乳源免疫活性肽的内容。