论文部分内容阅读
糖尿病神经病理性疼痛（diabetic neuropathic pain,DNP）是糖尿病（diabetes mel itus,DM）患者的常见并发症。该疼痛症状可急性发作,6个月内缓解,但大多数会发展成慢性痛,持续数年,导致患者焦虑、沮丧、失眠等,严重影响生活质量。由于DNP机制尚不清楚使其治疗成为临床一大难题。肾上腺髓质素（adrenomedullin,AM）是52个氨基酸的多肽,在神经系统中主要分布在背根神经节（dorsal root ganglion,DRG）的中小型神经元和脊髓背角（spinal dorsal horn,SDH）的I-II层中。近年来的研究表明,AM作为痛级联反应的较上游分子,参与神经病理性疼痛、炎症痛等多种疼痛的形成和发展。我们实验室前期的实验结果（未发表）表明,在链脲佐菌素（streptozotocin,STZ）诱导的DNP大鼠DRG和SDH,AM的m RN A显著上调,且鞘内注射AM受体拮抗剂AM22-52能够使得DNP大鼠的机械性痛敏和热超敏反应得到缓解。说明AM可能参与调控DNP,但对于AM参与的具体机制尚不清晰。本研究通过构建STZ诱导的DNP大鼠模型,运用行为学手段、免疫荧光组织化学方法、蛋白质免疫印迹、免疫荧光双标技术,探究AM参与DNP的机制。实验结果显示:（1）STZ诱发的DNP过程中,大鼠血糖保持持续性较高水平、体重持续降低,并表现为机械缩足阈值（mechanical withdrawal threshold,MWT）和热缩足反射潜伏期（withdrawal reflex thermal latency,WTL）显著降低,说明DNP模型建立成功。DNP的第28天,鞘内应用20 nmol的AM22-52能够提升DNP大鼠的MWT和WTL,说明AM参与调控DNP大鼠的机械痛敏和热超敏反应。（2）STZ诱导的DNP大鼠第28天,运用免疫荧光组织化学技术检测,DNP大鼠DRG的中小型神经元上大量表达AM,且鞘内应用20 nmol的AM22-52能够逆转上述AM的异常表达。DRG中小型神经元在疼痛的感觉和信息传递过程中具有重要的作用。说明AM的表达及生物学功能在DNP的形成和发展中具有重要作用。（3）STZ诱导的DNP大鼠第28天,运用蛋白免疫印迹技术检测,DNP大鼠DRG中卫星胶质细胞（satellite glial cells,SGCs）激活（神经胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）上调）、P2X7受体（P2RX7）上调、炎性因子（白细胞介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α））上调、神经元的兴奋性增强（瞬时电位香草素受体1（transient receptor potential vanilloid 1,TRPV1,又称VR1）上调）以及促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）家族（细胞外调节蛋白激酶（extracellular signal regulated kinase,ERK）、c-Jun N-末端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK））的磷酸化增多,且鞘内应用20 nmol的AM22-52可以逆转上述现象。说明抑制AM活动通过抑制SGCs的一系列活化,间接抑制神经元兴奋性增强,从而抑制外周敏化进程。此外,运用免疫荧光双标技术检测,AM能够部分与TRPV1共定位,说明除AM可能还可以通过直接激活DRG中的TRPV1表达从而参与外周敏化的进程。（4）STZ诱导的DNP大鼠第28天,运用蛋白免疫印迹技术检测,DNP大鼠SDH中小胶质细胞和星形胶质细胞激活、少突胶质细胞增殖受到抑制、P2RX7上调、单核细胞趋化蛋白1（monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1,又称CCL2）上调、神经元的兴奋性增强（c-fos上调）以及MAPK家族（ERK、JNK、P38）的磷酸化增多,且鞘内应用20 nmol的AM22-52可以逆转上述现象。运用免疫荧光双标技术检测,AM1受体的两个元件（降钙素受体样受体（calcitonin receptor-like receptor,CLR）和分子伴侣受体活性修饰蛋白2（receptor activity-modifying proteins2,RAMP2））与星形胶质细胞、小胶质细胞均存在共定位。说明,AM可通过作用于胶质细胞上AM1受体,直接调控胶质细胞的活动从而参与中枢敏化的进程。以上研究结果表明,DNP能够诱导AM的表达增加,阻断AM与AM1受体的结合可抑制AM的表达,从而缓解DNP的机械和热痛敏反应。AM作为较上游的痛介质,可能通过调控胶质细胞的活动,从而参与DNP的外周敏化和中枢敏化的进程。