松花粉多糖的提取、纯化、硫酸酯化及活性研究

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研究发现多糖具有增进免疫、抗肿瘤、抗病毒、抗感染、抗衰老、抗凝血、降血脂、降血糖等功能,已应用于临床的多糖有香菇多糖、裂褶多糖、云芝多糖等。近年来花粉多糖已经被人们开始注意,但关于松花粉多糖的研究国内外报道不多。松花粉具有增强免疫等多种生物功能,其中马尾松花粉应用最为广泛。阐明松花粉具体功效成分对于深层次开发松花粉具有重要意义,所以本实验对马尾松花粉多糖及活性进行了研究。实验具体分为以下四个部分:一、马尾松花粉多糖的提取与酯化改性:采用热水浸提法提取,40%、60%、80%乙醇分级沉淀,取60%分级多糖硫酸酯化法改性。总多糖提取得率为3.256±0.230%;酯化60%多糖改性得率为150.6%。二、马尾松花粉多糖的理化性质测定及纯化:定性和定量分析样品含糖量;HPLC分析单糖组分;凝胶层析各级分多糖,并使用核磁共振法对层析所得多糖样品进行初步结构分析。紫外光谱显示多糖无明显核酸蛋白杂质;红外光谱表明多糖主要具有糖类特征吸收峰,酯化60%多糖具有硫酯基团特征吸收峰。60%多糖校正含糖量为83.24%,排除硫酸基影响,基本都是多糖组分,酯化60%多糖硫酸基取代度为1.471;HPLC分析单糖组分得40%多糖主要含有葡萄糖、阿拉伯糖和半乳糖,60%松花粉多糖主要含有阿拉伯糖和半乳糖,80%多糖主要含有半乳糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖和甘露糖。40%多糖纯化得到6mg样品,核磁检测单糖组分仍不单一。三、马尾松花粉多糖的体内抗肿瘤研究及安全性初步分析:选取得率最高的60%多糖和酯化60%多糖作体内S180肉瘤实验,并对酯化60%多糖进行了经口和腹腔注射安全性分析。实验证明60%多糖最大抑瘤率为43.30%。毒副作用小,且具有促进免疫活性的功能。酯化60%多糖最大抑瘤率为69.27%,对S180荷瘤小鼠存活时间的延长率为60.05%,酯化改性后大大提高了多糖的抗肿瘤活性。体内免疫实验表明,酯化60%多糖促进NK细胞活性,促进率为81.89%;抑制IL-1β,抑制率为58.02%;促进IL-4,促进率为49.85%,说明调节免疫是其抑制肿瘤的机制之一。高剂量酯化60%多糖腹腔注射有毒性作用,分析其机制可能是影响肌肉收缩。四、马尾松花粉多糖对体外培养癌细胞和免疫细胞的作用:酯化60%多糖对HepG2、BGC-823、A549三种癌细胞有不同程度的直接抑制作用(非凋亡途径),其中对HepG2肝癌细胞的抑制率最高,为39.90%;对免疫细胞增殖或吞噬有很强的促进作用,其中对B、T淋巴细胞的促增殖率分别为221.4%,155.3%,对巨噬细胞吞噬促进率为53.44%,说明其通过增强免疫和杀伤癌细胞抑癌。60%多糖主要通过增强免疫抑癌。五、本实验首次从生理角度上发现了酯化多糖对哺乳动物肠道平滑肌收缩有抑制作用;60%多糖和酯化60%多糖对蟾蜍心肌收缩幅度主要有增强作用,对收缩频率有抑制作用。本实验表明松花粉酯化60%多糖具有作为一种新抗癌药物开发的潜能,且可在治疗肌肉组织相关疾病方面做探索研究。酯化60%多糖和未酯化松花粉多糖都具有增强免疫的功能,可作为免疫增强药物来开发。
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