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第一部分TPA基因预防移植静脉再狭窄的实验研究实验一pcDNA3.1-Myc-His B(-)/tPA基因新型真核表达载体的构建和鉴定目的构建人组织型纤溶酶原激活因子(tPA)基因的新型真核表达载体，为血栓相关性疾病的基因治疗奠定基础。方法将tPA基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1-Myc-His B(-)中，进行酶切鉴定及DNA测序分析。结果双酶切鉴定结果显示，pcDNA3.1-Myc-His B(-)/tPA经KpnI和NotI双酶切后，凝胶电泳见在约2.2kb和5.5kb处出现条带，与目的基因片段和载体片段相符；测序结果显示，该tPA基因序列与GenBank公布的基因序列一致，证实已将t-PA基因DNA片段正确插入到真核表达载体中。结论成功构建pcDNA3.1-Myc-His B(-)/t-PA基因新型真核表达载体。实验二转tPA基因内皮细胞纤溶活性的变化目的观察转染人组织型纤溶酶原激活因子(tPA)基因的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)纤溶酶活性变化。方法将已成功构建的tPA基因真核质粒pcDNA3.1-Myc-His B(-)/tPA经脂质体介导转染人脐静脉内皮细胞株，经G418抗性筛选，挑选出转染阳性克隆细胞，G418维持培养，RT-PCR检测tPA基因在转染细胞内的转录水平，Western印迹法检测转染细胞外源性tPA蛋白表达，酶联免疫吸附实验检测细胞培养上清tPA含量，底物发色法检测转染细胞tPA活性。结果半定量RT-PCR结果显示，转基因组、空载体组和空白对照组HUVECtPAmRNA相对含量分别0.94±0.20；0.32±0.15和0.36±0.16，转tPA基因组明显高于各对照组，其细胞培养上清tPA含量分别为612.36±116.12ng/10~6细胞/24h，59.17±21.18ng/10~6细胞/24h和57.42±18.83ng/10~6细胞/24h，转基因组明显高于各对照组；tPA活性分别为57.95±11.22IU/10~6细胞/24小时，4.65±1.40IU/10~6细胞/24小时和4.68±1.31/10~6细胞/24小时，转基因组tPA活性明显高于空载体组和空白对照组(P＜0.01)。用抗Myc标签抗体可检测到转tPA基因组外源性融合蛋白质表达，对照组则为阴性。结论构建的pcDNA3.1-Myc-HisB(-)/tPA基因新型真核表达载体，能在HUVEC中表达，其表达具有高拷贝、稳定性好的特点，获得的表达蛋白活性较高，提示本载体和稳定表达tPA基因的人脐静脉内皮株能够作为基因治疗工具用于哺乳动物的实验研究。实验三TPA基因体外转染对血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响目的探讨tPA基因体外转染对鼠血管平滑肌细胞(VSMC)黏附、增殖和迁移的影响，为tPA基因在预防移植血管再狭窄中的应用奠定理论基础。方法通过阳离子质体介导，将tPA基因转染体外培养鼠血管平滑肌细胞，RT-PCR、Western-Blot及ELSIA检测转基因平滑肌细胞基因表达，底物发色法检测转基因VSMC纤溶活性变化，MTT、细胞黏附、细胞迁移实验等方法，检测体外转染tPA基因对血管平滑肌细胞黏附、增殖和迁移的影响。结果RT-PCR和Western-Blot检测到转基因血管平滑肌细胞tPA基因转录及蛋白表达，转基因组、载体组和空白对照组tPA含量分别为518.38±125.32ng/10~6cells/24h，12.53±4.27ng/10~6cells/24h和13.21±5.02ng/10~6cells/24h，转基因组明显高于各对照组；转基因组tPA活性为26.6±7.02IU/10~6cells/24h，而载体组和空白对照组没有检测出tPA活性。转基因平滑肌细胞和对照组相比，其细胞的增殖、黏附和迁移能力没有明显变化。结论转tPA基因血管平滑肌细胞纤溶活性增高，但对血管平滑肌细胞的黏附、增殖和迁移能力没有影响。实验四局部转染TPA基因对移植静脉再狭窄的影响目的观察组织型纤溶酶原激活因子(tPA)局部转基因表达对移植静脉血栓形成和内膜增生的影响并探讨其机制。方法72只兔建立颈外静脉-颈总动脉移植模型，并随机分为基因治疗组(n=24)、载体对照组(n=24)和空白对照组(n=24)，进行局部基因转染，于术后不同时点取材，逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫印迹(Western-Blot)和底物发色法分别检测移植静脉tPA基因表达和活性变化，放射标记计数观察其对血小板沉积的影响，病理形态学观察移植血管新生内膜增生情况，免疫组织化学染色观察术后血小板源性生长因(PDGF)和转化生长因子β1(TGF-β1)在移植静脉管壁表达情况。结果术后2、5、14、28d，转基因组检测到移植静脉外源性tPAmRNA的转录和蛋白表达，其活性分别为370.63±59.44、344.13±48.47、252.87±51.80和161.75±68.94U/g，对照组各时点则未检测到纤溶酶活性。术后2d，转基因组、载体组和空白对照组平均血小板沉积数分别为85.04±21.58×10~6，225.87±85.13×10~6和211.57±78.02×10~6，转基因组明显少于载体组和空白对照组，(P＜0.05)。术后5、14、28、60d，转基因组新生内膜面积、内膜中膜面积比均明显小于对照组。术后2、5、14、28和60d，转基因组PDGH阳性细胞率低于个对照组(P＜0.05)。术后2、5、14和28天，转基因组TGF-β1阳性细胞率低于各对照组(P＜0.05)，术后60天，差异无统计学意义。结论局部转染tPA基因，能抑制移植静脉血栓形成，减轻新内膜的增殖，从而有效预防再狭窄的发生，其机制可能是通过抑制PDGF和TGF-β1的过度表达而实现的。第二部分明胶涂层的Dacron涤纶片携带tPA基因局部定位转移对兔左房血纤溶活性的影响目的探讨tPA基因左心房局部定位转移对兔左房血及外周血纤溶活性的影响。方法36只新西兰大耳白兔随机分为3组(每组12只)：基因治疗组(左心耳植入携带tPAcDNA的明胶涂层的Dacron涤纶片)；载体对照组(左心耳植入携带载体DNA的明胶涂层的Dacron片)和空白对照组(左心耳植入不携带任何基因的明胶涂层的Dacron片)，于术后3、14天取材，RT-PCR检测左房局部心肌组织tPAmRNA转录水平，Western-Blot和免疫组化方法检测外源性tPA蛋白表达；术后3天和14天，取兔左房血和外周血，底物发色法检测其tPA活性。结果术后3天、14天，RT-PCR可检测到局部心肌tPAmRNA表达，Western-Blot可检测到tPA蛋白表达，免疫组化见阳性细胞胞浆呈黄褐色，术后3、14天，转基因组左房血tPA活性高于各对照组，3组术前、术后外周血tPA活性差异无统计学意义。结论明胶蛋白涂层可作为一种有效的基因转移方法；携带tPA基因的明胶涂层的Dacron片，植入兔左心耳，能在局部表达、分泌tPA蛋白，从而使左房血纤溶活性增强。