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背景:在相关临床疾病如肝移植、肠移植、肠梗阻等的治疗中,部分血流阻断,已明确可以造成肠淤血损伤(ICI,Ischemia Reperfusion Injury);而当血流恢复再通后肠组织损伤并没有减轻,同时组织损伤产生的毒素、易位的菌群等随血流循环至远端器官以及全身,造成远隔组织器官的损伤,即肠淤血再灌注损伤(ICRI,Intestinal Congestion-reperfusion Injury)。相关研究表明凋亡在ICRI的发生机制中起重要作用。凋亡是一种经典的细胞死亡方式,而新近的研究表明以炎症性反应和细胞溶解破裂为特点的细胞焦亡同样是细胞的一种死亡方式。细胞焦亡的发生有两条途径,即半胱氨酸蛋白酶(caspase)家族中的caspase1/4/5/11介导的经典途径和脂多糖(LPS,Lipopolysaccharide)介导的非经典途径。在焦亡的经典途径中,当机体细胞受到内外各种有害刺激时,通过胞内的模式识别受体(pattern recognitions receptors,PRRs)识别病原体相关分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs)或损伤相关分子模式(danger associated molecular patterns,DAMPs),与/或接头蛋白ASC结合形成一种多蛋白复合物的炎性小体,并募集和激活caspase-1前体,活化的caspase-1对反应底物GSDMD进行切割,形成的N端GSDMD能够将细胞膜打孔并引起细胞的溶解性死亡,释放大量的炎症细胞及趋化因子等,加重炎症反应,引起组织的进一步损伤;在非经典途径中,LPS通过激活caspase-4/5(人)和caspase-11(小鼠)对GSDMD进行切割进而发生下一步反应。细胞焦亡的这种死亡方式已被广泛研究,存在于多种组织损伤中,炎症性肠病中也证实有细胞焦亡的参与,但目前为止,在ICRI中并没有明确的报道表明细胞焦亡参与其发生发展中。根据以上所述,我们猜想细胞焦亡也参与到ICRI的发生机制中并起到一定的重要作用,因此我们通过建立ICRI的动物模型,验证上述猜想并探讨ICRI的发生机制。目的:本实验通过建立小鼠肠淤血再灌注损伤的动物模型,检测细胞焦亡相关基因的表达,探讨细胞焦亡是否是小鼠在ICRI的损伤机制。方法:雄性C57BL/6小鼠142只(周龄8~10周,体重18~22 g,SPF级)被用于本实验研究。首先建立肠淤血损伤(ICI)模型,得出最佳的淤血长度和淤血时间后,进行下一步的肠淤血再灌注损伤(ICRI)模型的建立。具体如下所述。1.建立ICI模型。(1)进行生存分析观察:根据小鼠小肠的总长度,分别选取长度为10cm、15cm、20cm的肠管进行实验的分组,共4组,分别为假手术对照组(Control组,n=10)、淤血肠管10cm组(Congestion 10cm,C10组,n=10)、淤血肠管15cm组(Congestion 15cm,C15组,n=10)和淤血肠管20cm组(Congestion 10cm,C20组,n=10),使用11-0带针丝线分别结扎C10组、C15组、C20组的肠管系膜缘侧静脉血管,对照组不结扎血管,随后观察48h,记录小鼠生存情况并绘制生存曲线(Kaplan-Meier法),进行组间比较(Log-rank检验);2)获取标本:另取60只小鼠使用以上方法分别结扎,C10组(n=15)、C15组(n=15)、C20(n=15)组的肠管系膜缘侧静脉血管,control组处理同1)(n=15),分别留取淤血不同时间点(Control、0.5h,1h、1.5h、2h)的肠管标本各3份,进行常规HE染色后观察小肠组织的病理学改变,采用Chiu’s肠黏膜损伤评分方法对小肠黏膜的损伤进行评估,并通过Spearman相关性分析法分析不同组间和不同时间点损伤的相关性。最后得出小鼠肠淤血模型最佳的淤血长度和淤血时间的参数,用于后续实验。2.建立ICRI模型:以淤血肠管长度15cm、淤血时间1h,进行淤血再灌注损伤的(ICRI)研究。将雄性C57BL/6小鼠42只(周龄8~10周,体重18~22 g,SPF级),根据再灌注时间的不同进行分为7组,每组各6只,分别为:假手术对照组(Control组),ICR 0.5h组(再灌注0.5h)、ICR 1h组(再灌注1h)、ICR 1.5h组(再灌注1.5h)、ICR 2h组(再灌注2h)、ICR 2.5h组(再灌注2.5h)、ICR 3h组(再灌注3h)。使用11-0带针丝线,结扎肠管长度15cm、淤血时间1h后去掉结扎线,观察并采集上述再灌注不同时间点的小鼠血液和肠组织标本;提取血液标本的血清,运用生化检测仪对肝脏功能和心肌酶的水平情况进行检测;HE染色观察各组小鼠小肠的组织病理学改变;使用RT-PCR法和Western Blot法分别检测各组肠组织中细胞焦亡和炎症相关的基因的表达情况。结果:(1)使用丝线结扎肠系膜静脉血管成功建立了小鼠ICI模型,得出最佳模型条件为淤血肠管长度15cm、淤血时间1h,在此基础上又成功建立了ICRI模型;(2)肝功能和心肌酶的检测结果提示,各实验组与假手术对照组相比表达量均随着再灌注时间的延长而升高,其中ALT(ICR 2h组,p<0.01))、AST与LDH(ICR 1.5h组,p<0.01)、AST/ALT(ICR 2.5h,p<0.05)、CK(ICR 2.5h组,p<0.01)和CK-MB(ICR 1.5h组,p<0.01)的表达量显著升高,与对照组相比差异具有统计学意义。(3)HE染色情况发现假手术组在光镜下可见肠黏膜结构完整,绒毛排列整齐,细胞如常;ICI组和ICRI组在光镜下可见肠黏膜及绒毛结构受到不同程度的破坏,随着时间的延长,出现黏膜及上皮下间隙的扩张、绒毛顶部的缺失、固有膜的脱落、出血或局部溃疡的形成,同时伴有大量的炎性细胞浸润,在ICR 2.5h组或ICR 3h组开始有所缓解,且在ICR 3h组有淋巴滤泡的形成;ICI组损伤较ICRI程度轻。(4)在ICR后,细胞焦亡相关基因和蛋白的表达都随着再灌注时间的延长而升高,达到峰值后渐趋下降:1)相关mRNA的表达:(1)相较于对照组,细胞焦亡相关的基因caspase-1(ICR 1.5h组,p<0.05)、caspase-11(ICR 2.5h组,p<0.05)和NLRP3(ICR 1/1.5/2/2.5/3h组,p<0.05)表达均升高,差异具有统计学意义;GSDMD在ICR 0.5h组时降低,具有统计学意义(p<0.05);(2)相较于对照组,与炎症相关的TNF-α(ICR 1.5/2.5h组,p<0.05)、IL-1β(ICR 2/2.5h组,p<0.01)、MCP-1(ICR 2h组,p<0.0001)以及CXCL-1/2(ICR 2h组,p<0.01)均明显升高,差异具有显著统计学意义;2)相关蛋白的表达:(1)相较于对照组,细胞焦亡相关的蛋白AIM2(ICR 1h组,p<0.05)、ASC(ICR 1h组,p<0.01)、caspase-1(ICR 1h组,p<0.05)、GSDMD(ICR 1h组,p<0.01)和参与非经典焦亡途径的caspase-11(ICR 1h组,p<0.01)表达升高,差异具有统计学意义;(2)与炎症相关的IL-1β(ICR 1h组,p<0.01)、IL-18(ICR 1.5/3h组,p<0.01)、TNF-α(6个组,p<0.01)、MCP-1(ICR 2 h组,p<0.01)、CXCL-1/2(ICR 2h组,p<0.01)与对照组相比在实验组表达明显升高,差异具有统计学意义。结论:1.以淤血肠管长度15cm、淤血时间1h为参数成功建立小鼠ICI模型和ICRI模型;2.细胞焦亡的经典途径(由caspase-1介导)和非经典途径(由caspase-11介导)均有参与了ICRI过程;3.经典的促炎因子TNF-α、白介素家族IL-1β和IL-18、MCP-1以及趋化因子家族成员CXCL1/2均有参与到在ICRI炎症反应的发生发展过程中;4.在ICRI过程可造成远隔器官如肝脏和心脏的功能损伤。