背景:生物分子包含生物体内的蛋白、核酸、糖类等大、小分子物质,作为生物体内主要的活性成分,其在促进新陈代谢、维持供能、促进生长发育、传递遗传信息、产生免疫等方面起着重要作用。其中蛋白、核酸类生物标志物的有无或丰度高低对于疾病的预防、早期诊断、治疗监控具有重要意义。目前,常规的生物分子检测技术有免疫学检测技术和分子生物学检测技术。两类方法虽然在临床上得以广泛应用,但因其耗时、操作复杂,依赖特殊的仪器设备,不适用于临床快速、便携、POCT的需求,极大的限制了生物分子在临床诊断中的应用价值。因此,寻找一种快速、准确、便携、高灵敏、成本低廉的生物分子检测平台,对生物分子用于临床早期诊断、治疗以及生理状态监测具有重要意义。目的:以价格便宜、形状可控的纸基材料为基底,构建超敏的生物分子检测识别技术,实现蛋白类分子快速鉴定。通过对痕量核酸类分子准确定量,为生物分子检测提供一种全新的思路和方法。从根本上降低检测成本,简便操作过程,缩短响应时间,提高检测灵密度,实现仪器设备小型化、便携化,为复杂环境或贫困地区生物分子检测创造条件。方法与结果:本研究开发了基于纸基芯片检测生物分子的关键技术,实现了对蛋白和核酸的快速、高效检测。第一部分:基于染料显色的血型鉴定纸基芯片技术构建1.通过不同纸基材料孔径大小、结构排列的筛选,以及对全血层析情况对比,选用玻璃纤维膜作为层析垫和加样垫,棉浆纸作为抗体垫和反应垫进行血型纸基芯片的构建;进一步筛选出GF2型分离膜用于全血血浆分离,通过分离的血浆与相应试剂红细胞是否发生凝集,并结合溴甲酚绿(BCG)与血浆/全血反应颜色的不同判读血型结果。进一步为提高血型鉴定纸基芯片检测的效率,我们对红细胞抗原和抗体浓度进行优化,结果表明20%的试剂红细胞为最佳反定型抗原浓度,包被在纸基芯片上的抗A、抗B最适稀释浓度为1/32,抗D最适稀释浓度为1/64。2.以BCG与人血清白蛋白(HAS)特异性结合产生蓝绿色变化,BCG与全血反应产生褐色变化的特性,并结合检测特征光谱辅助判读结果,从而建立了以BCG作为显色剂的血型鉴定技术,同时该技术不受类血液颜色物质的干扰,极大提高检测的准确性和灵敏度。3.成功实现2min内无需离心的ABO正反定型同步血型检测,同时实现了30s内ABO正定型和ABD血型检测,本研究以纸基材料为基础建立的快速、便携血型鉴定芯片,为血型鉴定在极端条件下的应用提供了可能。第二部分:基于纸基石墨烯阵列芯片的核酸检测平台构建1.选用均匀、表面较为光滑的碳纸为基底,采用等离子体增强化学气相沉积(PECVD)的方式垂直生长石墨烯阵列,最后通过电化学沉积AuNPs,构建出纸基石墨烯阵列芯片电极。其极大的增加了电极有效的比表面积,从而提升了探针在电极上包被的容量;此外,纸基芯片电极上的石墨烯阵列呈现为排列紧凑、分布均一的三维网络结构并垂直竖立在碳纸表面,增加了靶标miRNA与石墨烯阵列上固定的探针之间来回碰撞的频率,从而提高有效杂交的机会,保证检测的灵敏度。2.利用双链特异性核酸酶(DSN)实现信号放大,在靶标miRNA存在的条件下,电活性物质修饰的DNA探针和靶标miRNA形成双链DNA-miRNA复合物,DSN酶切降解DNA-miRNA复合体中的DNA,释放靶标miRNA,并重新与剩余的DNA探针杂交,开始新一轮酶切、释放和杂交过程,使大量DNA探针上的电活性物质脱离电极表面,导致电化学信号改变,实现将痕量miRNA检测转化成特征性的电化学响应信号输出。同时,利用DSN酶对核酸序列单碱基差异区分的能力,确保了纸基石墨烯阵列芯电极片对miRNA检测良好的特异性。3.所构建的纸基石墨烯阵列芯片传感器可实现对miRNA-155和miRNA-21并行同步检测,具有良好的线性响应。其线性范围为:100 aM-10 nM,线性方程分别为:Y=4.98logC+89.11和Y=5.69 logC+103.34,具有潜在的应用价值。结论:本研究中,基于纸基材料构建的生物分子检测芯片传感器,具有准确性高,响应速度快,便于携带,检测成本低的特点,且其制作方法简单、成本低廉,易于大批量生产和大范围推广应用,在复杂环境下,特别是偏远地区或者贫困地区具有重要的应用价值和意义。