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稻瘟病是水稻上的三大病害之一,由稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起。对稻瘟病菌的深入研究对于防治水稻稻瘟病具有重要意义。稻瘟病菌是一种重要的丝状子囊真菌,并具有典型的致病机制和侵染循环,其与水稻之间的互作已成为研究病原真菌与植物之间互作的重要模式。随着研究的深入,发现过氧化物酶体对稻瘟病菌的致病性起着至关重要的作用。过氧化物酶体(peroxisome)是真核生物细胞中普遍存在的一类单层膜细胞器,其内含有丰富的酶类,参与多种生理生化的代谢过程,如乙醛酸循环、活性氧的调节以及脂肪酸的β-氧化等。过氧化物酶体由内质网产生,自身不含DNA,基质蛋白和膜蛋白是由核基因编码,在细胞质中合成,靠过氧化物酶体定位信号(Peroxisome targeting signal,PTS)识别并转运到过氧化物酶体内。参与过氧化物酶体形成的基因称为PEX基因,编码蛋白称为Peroxins。PTS1的受体是PEX5基因,PTS2的受体是PEX7基因,辅助受体是PEX20基因。本研究组曾对稻瘟病菌PEX7(MoPEX7)和PEX20(MoPE20)进行了初步分析,发现两个基因对病菌生长发育和致病性均有较大的影响,但具体作用并不完全相同。为了进一步探究PEX7和PEX20在过氧化物酶体形成中的具体分工和在病菌生长发育过程中的作用的异同,本文通过分析稻瘟病菌MoPEX7和MoPEX20基因的单敲和双敲突变体,对稻瘟病菌PEX7、PEX20及PEX7PEX20基因的功能进行了比较和分析,结果如下:1.构建含有G418抗性基因(NEO)的MoPEX7基因置换载体,通过ATMT导入△mopex20(实验室保存,潮霉素抗性),获得双敲突变体△pex20△pex7.2.在CM培养基上,△pex7、△pex20及△pex20△pex7的生长速率上没有明显差异,△mopex7的菌落形态较野生型没有明显差异,产孢量有下降;而△mopex20和△pex20△pex7的菌落气生菌丝明显变得稀薄,产孢量下降。3.观察含有PTS1与PTS2的蛋白定位发现,△pex7、△pex20及△pex20△pex7突变体中PTS1的定位与野生型无差异,PTS2的定位均造成影响。4.测定在大麦和水稻上的致病性,发现△pex7、△pex20及△pex20△pex7的致病性均减弱,其中△pex20△pex7的致病性减弱更为显著。5.利用 MM、MM-C、MM-C+0.5%Tween80、MM-C+0.5%Olive、MM-C+0.5%Oleic acid、MM-C+50mM CH3COONa培养基进行营养利用试验,发现△pex7、△pex20及△pex20△pex7均不能正常利用长链脂肪酸,但可以利用CH3COONa做碳源,但利用率稍有下降。6.在含有 100g/ml Congo red 和 150g/ml calcofluor white 的培养基上,△pex7、△pex20及△pex20pex7突变体的生长均受到抑制。在Congo red培养基上△pex7抑制率与△pex20相差不大,在calcofluor white培养基上△?ex7的抑制率与△pex20相差不明显,而△pex20△pex7的抑制率明显大。说明这两个基因是相互作用共同调节细胞壁的完整性。7.在含有Methylviologen的培养基上培养,发现△pex7、△pex20及△pex20△pex7突变体对活性氧的耐受性与野生型相比下降,同时△pex20和△pex20△pex7的耐受性较△pex7为低.8.在Terylene膜上对诱导孢子萌发和附着胞的形成,发现△pex7、△pex20及△pex20△pex7突变体的萌发率与野生型相比没有明显差异,△pex7附着胞形成率与△pex20相差不大,而△pex20△pex7的附着胞形成率明显降低.9.观察△pex7、△pex20及△pex20△pex7突变体在大麦叶片上的侵染结构发现,在接种36h后,突变体都能成功侵染并形成侵染菌丝,但△pex7的侵染菌丝比△pex20的少。10.对△pex7、△pex20及△pex20△pex7突变体的黑色素产量测定发现,△pex7的黑色素产量明显高于△pex20和△pex20△pex7.11.对突变体进行脂肪粒染色发现,附着胞形成过程中△pex7、△pex20及△pex20△pex7孢子和芽管内残存有脂肪粒,并且始终不能转移入附着胞中。综上所述,突变体△办ex7和△pex20在菌落形态、产孢量、致病性、细胞壁完整性、黑色素产量及对活性氧的耐受性等方面均存在不同程度的差异。暗示着,在过氧化物酶体形成过程中,除了作为PTS2共受体与P一起参与蛋白转运之外,PEX-20可能还参与别的途径。