内源性β-ODAP是限制山黧豆开发利用的关键因素,但其生物合成途径的关键基因和蛋白研究极少,调控途径尚不明晰。本研究取山黧豆种子萌发期具有不同β-ODAP含量的组织分别进行了转录组学、代谢组学及联合分析,并对β-ODAP合成的关键基因b-腈基丙氨酸合成酶基因进行了功能研究。获得的主要研究结果如下:1.通过转录组学分析,在2DAS,6DAS及25DAS的不同组织中共找到6,589个差异基因。GO、KEGG分析表明,β-ODAP含量与碳代谢、硫同化/代谢等基础代谢有关。WGCNA分析将上述差异基因分为61个模块,其中两个模块与CSase基因相关,说明CSase家族蛋白可能参与β-ODAP积累水平调控。在山黧豆转录组数据库中共找到8条LsCSase序列,分别属于CYSA,CYSB,CYSC,CYSD及SCS五个家族,其中属于CYSC家族的LsCASase可能是β-ODAP生物合成中的关键酶。2.通过代谢组学分析,在2DAS,6DAS及25DAS的不同组织中共检测到了包括氨基酸、碳水化合物、嘌呤等在内的141个差异代谢物。PCA分析表明上述代谢物随β-ODAP含量的变化而变化。OPLS-DA,层次聚类及pathway分析等结果进一步表明,β-ODAP代谢与氮代谢、硫代谢、氨基酸代谢、核酸代谢等初级代谢有关。3.通过mapman软件进行代谢组学和转录组学联合分析,构建差异代谢物-基因相关性关系网络,发现硫代谢、TCA循环及氨基酸代谢中的部分代谢物和基因与β-ODAP呈现出了相同的变化趋势。4.酶活性测定结果表明,LsCASase是同时具有CAS和CS两种酶活性的双功能酶。pH对两种酶活性的影响较大,在pH<8.0时主要发挥CS活性,在pH>8.0时主要发挥CAS活性。温度对两种酶活性的影响不显著,且LsCASase在低温时仍能保持较高的两种酶活性。ZnSO₄、MgSO₄、FeSO₄及β-ME处理均增加了LsCASase的两种酶活性,而CuSO₄处理则抑制了CS酶活性、增加了CAS活性。LsCASase两种酶活性的最适底物浓度不同,CS活性的最适底物浓度分别为0.5mM OAS、6mM Na₂S;CAS活性的最适底物浓度分别为7.5mM KCN、3mM Cys。关键氨基酸残基突变及酶活性测定结果表明,Lys¹⁰³是LsCASase能否发挥正常活性的关键氨基酸残基,而M²³⁵及S²³⁹是LsCASase两种酶活性比率的关键控制位点。5.亚细胞定位结果表明,LsCASase、LsSAT2、LsSAT3蛋白均定位于线粒体。酵母双杂交、双分子荧光互补及pull down试验结果表明,LsCASase能够与LsSAT2、LsSAT3发生相互作用。LsCASase与LsSAT2或LsSAT3所形成的的复合体可能通过影响Cys与异噁唑-5-酮合成BIA的方式调控β-ODAP的合成。6.蛋白三维结构、酶活性中心及互作位点的预测表明,LsCASase为同源二聚体,活性中心为:K¹⁰³、N¹³⁴、M²³⁵、G²³⁶、I²³⁷、G²³⁸、S²³⁹、G²⁴⁰、G²⁴¹、T²⁴²、T²⁸¹、G²⁸²;LsSAT2是由两个三聚体构成的六聚体,其底物Ser结合位点:D²⁶⁵、D²⁷⁹、H²⁸⁰、E²⁸¹、G³⁰⁶、R³¹⁴;CoA结合位点:D²⁷⁹、H²⁸⁰、H³⁰⁰、G³⁰⁶、A³²⁶、K³⁴¹、A³⁴⁴、T³⁵⁷。互作位点预测及pull down实验结果表明,LsCASase的T¹³¹、S¹³²、Q²⁰⁴三个位点是它与LsSAT2互作的关键位点。LsCASase突变体的Cys合成酶活性几乎完全丧失,CAS活性受影响较小。上述研究结果表明,山黧豆β-ODAP代谢与硫、氮、碳等基础代谢途径密切相关。LsCASase处于上述代谢的节点,并通过与LsSAT2、LsSAT3蛋白形成CRC复合物,在线粒体中对β-ODAP的合成起关键调控作用。这为进一步研究β-ODAP调控的分子机制,通过硫代谢通路关键酶的遗传操作改善山黧豆种子品质,尤其是提高含硫营养含量提供了理论依据。