半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis),是一种在我国沿海地区均有分布的栖息于底层的鱼类,具有生长快、营养丰富等优点,已成为珍贵的养殖鱼类之一。近年来,随着养殖规模的扩大,水体环境的恶化,半滑舌鳎养殖业面临着一系列严重的细菌病害威胁。水体环境中存在大量病原体可诱发其养殖过程中疾病频发,带来了巨大的经济损失,严重制约了其养殖业的进一步健康发展。因此,为了改变这一困境,对半滑舌鳎免疫相关基因及其免疫机制的探究迫在眉睫。其中肿瘤坏死因子家族(tumor necrosis factor superfamily)与其受体家族作为免疫系统中的重要成员,在半滑舌鳎免疫及炎症反应过程中具有重要的作用。本实验根据已公布的半滑舌鳎全基因组序列结果,从半滑舌鳎中克隆得到TNF-α1、TNF-α2和CD40等3个免疫相关基因,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测了3个免疫相关基因在各组织中的表达模式,分析了哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)刺激下三个免疫基因在3个主要免疫组织中的表达规律,并结合基因序列及进化特征,初步揭示了三个基因在半滑舌鳎免疫防御系统中的作用。同时,本文还验证得到CD40基因启动子区域序列,利用亚硫酸氢钠测序法(bisulfite-sequencing PCR,BSP)对2014年建立的2个经V.harveyi感染后死亡率不同的半滑舌鳎家系,其CD40基因启动子CpG富含区甲基化程度进行了探究。取得结果如下所示:1、根据半滑舌鳎全基因组测序结果,利用RACE技术克隆得到2个肿瘤坏死因子α同源基因,分别命名为TNF-α1和TNF-α2。其中TNF-α1和TNF-α2 cDNA全长分别为1264 nt和1186 nt,开放阅读框分别为729 nt和744 nt,分别可编码242和247个氨基酸。推导得到的TNF-α1和TNF-α2氨基酸都含有1个跨膜结构区、1个TNF超家族标签、1个TNF-α转移酶切位点以及2个保守的半胱氨酸残基。不同物种TNF-α氨基酸同源分析结果显示与哺乳类、两栖类以及硬骨鱼类相似性分别为38%~61%和35%~68%,均与硬骨鱼类相似性较高,而TNF-α1和TNF-α2前体膜蛋白相似性仅为32.94%,分泌型蛋白相似性为44.63%。系统进化分析显示半滑舌鳎TNF-α与其他硬骨鱼类TNF-α聚类为一支,其他物种TNF-α与LT聚类为一支,同时研究发现,与氨基酸比较结果一致,TNF-α1和TNF-α2两者亲缘关系较远。qRT-PCR分析显示,TNF-α1和TNF-α2在各组织中均有表达,且TNF-α1和TNF-α2在各组织中具有不同的表达模式,其中TNF-α1在肝脏和脾脏中具有较高表达,在其他组织中表达量较低;而TNF-α2在肾脏与肝脏中较高表达,在脑与脾脏中表达量较低。经V.harveyi感染刺激后,与PBS处理的对照组相比,TNF-α1和TNF-α2在半滑舌鳎3个主要免疫组织(肝脏、脾脏和肾脏)中表达量均呈显著性升高,其中在肝脏中TNF-α1于12 h表达量达到峰值,TNF-α2于6 h表达量达到峰值;在脾脏中TNF-α1于6 h与12 h均有较高表达量,而TNF-α2于6 h表达量达到峰值,且24 h时表达量又一次上调;在肾脏中TNF-α1于6 h表达量达到峰值,而TNF-α2于24 h表达量达到峰值。上述研究表明TNF-α1和TNF-α2基因参与了半滑舌鳎抵抗V.harveyi入侵的免疫应答反应。2、根据半滑舌鳎全基因测序结果,利用RACE技术克隆得到1个CD40同源基因。该基因cDNA全长为2098 nt,开放阅读框为1011 nt,可编码336个氨基酸。推导得到的CD40氨基酸包含有1个信号肽、1个跨膜结构区、2个N-糖基化位点以及含4个保守半胱氨酸的结构区。不同物种CD40氨基酸同源分析结果显示与哺乳类、两栖类以及硬骨鱼类相似性为28%~47%,其中与硬骨鱼类相似性较高。系统进化分析显示半滑舌鳎CD40与其他硬骨鱼类CD40聚类为一支,哺乳类与两栖类CD40分别聚类为一支。qRT-PCR分析显示,CD40在半滑舌鳎各组织中均有表达,其中在鳃、肝脏和脾脏等免疫组织中表达量较高,在肠、肌肉和皮肤中表达量较低,在脑和肾脏中呈微量表达。经V.harveyi刺激后,与PBS处理的对照组相比,该基因在半滑舌鳎3个主要免疫组织(肝脏、脾脏和肾脏)中表达量均呈显著性升高,其中在肝脏中12 h表达量到达峰值,在脾脏和肾脏中均于6 h表达量达到峰值。上述表明CD40基因作为一种受体分子参与了半滑舌鳎抵抗Vibrio harveyi入侵的免疫应答反应。同时验证得到CD40基因5′端上游长度为1522 nt启动子区域,对抗病家系与易感家系肝脏、肾脏以及脾脏中CD40基因启动子区甲基化分析结果显示,CD40基因甲基化率在抗病与易感家系中存在差异性,且10与11号CG位点,易感家系在3个免疫组织中甲基化程度明显高于抗病家系,但本底mRNA丰度并不存在差异。