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第一部分IL-36β通过激活mTORC1介导CD8+T细胞活化的效应及其机制目的:CD8+T细胞是机体特异性免疫应答中最主要的抗肿瘤效应性细胞群体。白细胞介素-36(Interleukin-36,IL-36)包括 3 种激动剂 IL-36α,IL-36β 和 IL-36γ,可作用于同一受体IL-36R。本部分旨在论证IL-36β是否能促进CD8+T细胞活化,并在此基础上以IL-36β为手段,探讨其激发的IL-36/IL-36R信号介导CD8+T细胞活化的分子机制。方法:从C57BL/6j小鼠中分离出初始CD8+T细胞,采用羧基荧光素琥珀酰酯(5-(and-6)-Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester,CFSE)进行标记或不标记,在IL-36β、IL-2和IL-12单独或联合作用下,利用抗CD3和抗CD28激发型单克隆抗体进行包板刺激。采用流式细胞术,检测早期活化标志CD69和CD25的表达,通过检测CFSE分析CD8+T细胞增殖;利用ELISA方法检测培养上清中IL-2和IFN-y的水平;采用流式细胞术或Westerm blot检测哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin,mTOR,mTORC1)下游磷酸化的核糖体蛋白S6(p-S6)、磷酸化的Akt(p-Akt)和IκB的降解程度;在加或不加入mTORC1特异性抑制剂雷帕霉素(Rapamycin)、磷脂酰肌醇激酶(Phosphoinositide 3-Kinase,PI3K)抑制剂或 κB 抑制蛋白激酶(Inhibitor of Nuclear Factor Kappa-B Kinase,IKK)的抑制剂后,分别用流式细胞术或 Western blot 检测 p-S6;将髓样分化因子 88(Myeloid Differentiation Factor 88,MyD88)缺陷小鼠来源的CD8+T细胞进行刺激,分析CD8+T细胞p-S6、细胞活化、IL-2和IFN-γ表达及细胞增殖。结果:结果表明,IL-36β能显著促进CD8+T细胞的活化与增殖,在刺激的早期,IL-36β即可促进IL-2和IFN-γ的产生(p<0.05)。IL-36β可促进CD8+T细胞mTORC1下游信号分子S6的磷酸化作用;而雷帕霉素完全抑制了 IL-36β介导的CD8+T细胞mTORC1活化,并同时抑制了细胞生长、增殖及IL-2和IFN-γ的分泌(p<0.05)。IL-36β可上调Akt的磷酸化,但在PI3K抑制剂的存在下,IL-36β诱导的S6磷酸化水平被抑制。IL-36β可以显著促进IκB的降解;而对IKK活性的抑制,则导致IL-36β介导的S6磷酸化部分被下调。MyD88缺陷使得IL-36β介导的CD8+T细胞S6磷酸化几乎被抑制;并且由于MyD88缺陷导致mTORC1失活,使得IL-36β介导的细胞生长、增殖和细胞因子产生均受到了抑制(p<0.05)。结论:本部分研究阐明了 IL-36β可通过PI3K/Akt、IKK和MyD88途径激活mTORC1信号,介导CD8+T细胞的活化和增殖。第二部分IL-36β促进CD8+TILs抗肿瘤免疫应答的效应目的:CD8+肿瘤浸润淋巴细胞(Tumor-Infiltrating Lymphocytes,TILs)往往受到抑制,而处于一种功能耗竭状态,通过合适的手段与方法恢复或增强CD8+TILs的功能,是激发肿瘤免疫应答和杀灭肿瘤的有效途径。本部分研究了 IL-36β在肿瘤微环境中对CD8+TILs功能的促进效应,及其对肿瘤生长的抑制作用。方法:通过基因转染制备过表达IL-36β的细胞胞株4T1-IL-36β和B16-IL-36β,及对照4T1-vec和B16-vec,将其分别皮下注射到BALB/c或C57BL/6j小鼠,监测肿瘤生长并观察小鼠生存期。在B16-vec和B16-IL-36β肿瘤生长的第23天,采用流式细胞术分析CD8+ TILs的比例、核增殖抗原Ki67表达和IFN-γ分泌;并同时分析肿瘤微环境中CD45+群体、NK和γδT细胞比例,以及检测髓系来源的抑制性细胞(Myeloid-Derived Suppressor Cells,MDSCs)的比例及其主要组织相容性复合体Ⅱ类分子(Major Histocompatibility Complex Ⅱ,MHC-Ⅱ)分子的表达。通过 ex vivo 实验,利用ELISA方法检测4T1-vec和4T1-IL-36β荷瘤小鼠体内肿瘤抗原特异性CD8+ T释放IFN-γ的水平。结果:结果表明,IL-36β对乳腺癌4T1和黑色素瘤B16的生长均有较明显的抑制作用(p<0.05);同时,IL-36β显著延长了黑色素瘤B16荷瘤小鼠的存活时间(p<0.05)。IL-36β显著增加CD8+TILs的数量,促进CD8+ TILs的增殖,促进CD8+TILs分泌IFN-γ(p<0.05),并增强适应性肿瘤抗原特异性CD8+T细胞免疫应答。同时,IL-36β促进了 CD45+细胞中CD4+T、NK和γδT细胞比例增加(p<0.05)。此外,IL-36β下调了中性粒样髓系来源的抑制细胞(Neutrophil Myeloid Derived-Suppressor Cells,NMDSCs),同时上调了 MHC-Ⅱ类分子在NMDSCs和单核样髓系来源的抑制细胞(Monocytic Myeloid Derived-Suppressor Cells,MMDSCs)上的表达(p<0.05)。结论:IL-36β能抑制肿瘤生长、延长荷瘤小鼠的生存期;其能改变肿瘤免疫微环境,对CD8+TILs的功能具有明显的促进作用,并能上调肿瘤抗原特异性CD8+TILs应答。