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研究背景和目的:肝癌是我国高发的恶性肿瘤,而广西又是高发地区。肝癌的复发和转移是治疗和预后不良的关键。恶性肿瘤的转移过程主要包括肿瘤细胞从原发部位脱离,浸润细胞外基质,侵入淋巴管或血管,粘附在血管远处内皮细胞壁并向血管外迁移,形成新的转移灶等步骤。细胞外基质的降解是癌转移的必经步骤,基质蛋白水解主要通过组织蛋白酶/uPA/uPAR/MMPs/纤溶酶原网络系统实现,尿激酶型纤溶酶原激活物（urokinase typeplasminogen activator,uPA）在该过程中起关键作用。它被组织蛋白酶激活,继而激活纤溶酶原,再激活基质金属蛋白酶（Matrix Metalloproteinases,MMPs）,发挥降解细胞外基质的作用。uPA和MMPs的过表达与许多肿瘤转移相关。大多数实体肿瘤是缺氧的,癌细胞通过葡萄糖酵解获得能量,酵解代谢过程产生多量的酸性产物,癌细胞尤其是有高转移潜能的癌细胞通常采取质子泵即Vacuolar-type H（+）-ATPase（V-ATPase）的途径将多产生的H+泵出细胞外,从而维持细胞内pH值稳定在正常范围,以保证细胞不因酸中毒而凋亡,同时造成癌细胞外酸性微环境。研究表明,能够在酸性环境中生存的癌细胞浸润能力增强,在酸性环境中组织蛋白酶、uPA和MMPs分泌增多且发生重新分布,在癌细胞表面和侵袭前缘分布增多,有利于侵袭、浸润和转移的发生。抑制V-ATPase能够抑制癌细胞酸性产物的排出,导致细胞内酸中毒凋亡,同时削弱癌细胞外酸性环境,不利于基质蛋白水解酶的分泌及细胞外基质的降解。过去关于HCC的研究以癌基因及旁路通道为主,尚未见将肿瘤微环境与肝癌相联系研究的报道。我们研究uPA和V-ATPase与肝癌发生和转移的关系,同时探讨抑制V-ATPase、干扰癌细胞H+泵出,使癌细胞酸中毒凋亡,寻找临床治疗的一个新的有效的靶点。材料和方法:1.标本来源:肝癌组织标本来源于2004年9月-2006年4月广西医科大学第一附属医院肝胆外科肝癌患者手术切除的病例共45例,取癌和癌旁组织,以距离癌肿边缘2cm以远为癌旁组织,其中,男39例,女6例,年龄21-72岁。以7例肝血管瘤旁组织做对照组。低转移潜能肝癌细胞株HCC97L购于复旦大学上海中山医院肝癌研究所。2.用RT-PCR和免疫组化SP法检测肝癌组织中uPA、MMP-9和V-ATPasemRNA和蛋白的表达;并分析它们表达间的相关性;将实验结果与病理、临床资料（伴有静脉癌栓及肝内外转移形成、乙型肝炎病毒感染、病理分级、血清AFP水平、肿瘤直径）进行比较分析。3.从肝癌组织中提取RNA,克隆uPA基因,构建原核表达载体,酶切鉴定,并送测序。4.构建真核表达载体,将重组质粒pCMV-uPA-HA送测序。将其转染低转移肝癌HCC97L细胞株,用抗生素筛选法筛选稳定转染细胞株,用RT-PCR和Western blot鉴定转染是否成功。5.用RT-PCR和western blot以及细胞免疫化学检测转染uPA细胞株和转染空载体细胞株中uPA及V-ATPase mRNA和蛋白的表达;6.肿瘤细胞体外迁移实验比较转染uPA基因和转染空载体细胞株的迁移能力;7.在细胞培养基中分别加入50和100nM浓度的V-ATPase抑制剂Bafilomycin A 1,肿瘤细胞体外迁移实验比较转染uPA基因细胞在Bafilomycin A 1的作用下迁移能力的变化;8.在细胞培养基中分别加入300、400、500nM的Bafilomycin A 1,12小时后收集细胞,用流式分析仪检测细胞凋亡情况;9.在细胞培养基中分别加入500、600、700nM Bafilomycin A 1,用CKK-8试剂盒检测在药物作用下细胞受抑制情况。结果:1.45例肝癌组织中伴有门静脉癌栓和/或肝内外转移者20例,不伴者25例,其它尚按病理分级、肿物直径、乙肝病毒感染、AFP水平分组;2.uPA mRNA在肝癌组、癌旁组和对照组表达阳性率分别为100%（45/45）、84.44%（38/45）,和28.57%（2/7）;癌与癌旁组及正常对照组比较均有显著性差异（P＜0.01,P＜0.05）。uPA蛋白表达阳性率在肝癌组、癌旁组和对照组分别为75.56%（34/45）、26.67%（12/45）、28.57%（2/7）,癌组分别与癌旁组及对照组比较有显著性差异（P＜0.01,P＜0.05）。肝癌组织中uPA mRNA和蛋白的表达与肝内外转移明显有关（P＜0.01）,而与乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染、病理分级、血清AFP水平以及肿瘤直径无明显关系（P＞0.05）。3.MMP-9 mRNA在肝癌组、癌旁组和对照组表达阳性率分别为100%（45/45）、86.67%（39/45）、57.14%（4/7）;癌组分别与癌旁组及对照组比较有显著性差异（P＜0.01,P＜0.05）。MMP-9蛋白表达阳性率在肝癌组、癌旁组和对照组分别为66.67%（30/45）、22.22%（10/45）、14.29%（1/7）,癌组与癌旁组相比、癌组与对照组相比有显著性差异（P＜0.01,P＜0.05）。MMP-9 mRNA和蛋白的表达与静脉癌栓形成、肝内外转移明显有关（P＜0.01）,而与HBV感染、病理分级、血清AFP水平以及肿瘤直径无明显关系（P＞0.05）。4.V-ATPase mRNA在肝癌组、癌旁组和对照组表达阳性率分别为100%（45/45）、86.67%（39/45）和71.43%（5/7）;癌与癌旁组及正常对照组的阳性表达比较均有显著性差异（P＜0.05,P＜0.05）。V-ATPase蛋白在肝癌组、癌旁组和对照组表达阳性率分别为82.22%（30/45）、51.11%（10/45）、42.86%（3/7）,癌与癌旁组及正常对照组的阳性表达比较均有显著性差异（P＜0.05,P＜0.05）。V-ATP-ase mRNA和蛋白的表达与静脉癌栓形成、肝内外转移明显有关（P＜0.01）,而与HBV感染、病理分级、血清AFP水平以及肿瘤直径无显著相关（P＞0.05）。uPA mRNA与MMP-9 mRNA的表达呈正相关,uPA蛋白与MMP-9蛋白的表达亦呈正相关;uPA mRNA与V-ATP-ase mRNA的表达呈正相关,uPA蛋白与V-ATP-ase蛋白的表达亦呈正相关。5.从人肝癌组织中成功克隆uPA基因编码区,长度1332bp;成功构建真核表达载体pCMV-uPA-HA并测序,转染低转移潜能肝癌细胞株,获得稳定转染pCMV-uPA-HA HCC97L肝癌细胞株。经RT-PCR和Western blot检测,稳定转染株pCMV-uPA-HA细胞的uPA mRNA和uPA蛋白表达明显强于转染pCMV-HA细胞株和未转染细胞株。6.RT-PCR和Western blot方法检测表明,uPA、V-ATPase mRNA和蛋白的表达在转染uPA基因细胞株均强于转染空载体细胞株;细胞免疫化学显示,uPA和V-ATPase在转uPA基因细胞株的阳性表达明显强于转空载体细胞株,阳性物质定位于细胞浆和细胞膜,V-ATPase在胞膜的表达突出。7.肿瘤细胞体外迁移实验结果显示,转uPA基因细胞株覆盖创痕的速度快于转空载体株,提示细胞uPA合成、分泌和表达增强,促进癌细胞的迁移、浸润和转移。8.培养基中加入Bafilomycin A 1,细胞覆盖创痕的速度降低;100 nM浓度的抑制用作强于50nM;提示Bafilomycin A 1抑制V-ATPase,继而抑制细胞的迁移运动能力。9.流式仪器检测细胞凋亡实验:培养基中加入药物浓度为300、400、500nM的Bafilomycin A1,对照组凋亡率是1.22%,药物实验组凋亡率分别为4.31%、7.48%和20.6%;10.CKK-8试剂盒检测细胞抑制率:在培养基中加入500、600、700nM的bafilomycin A1药物,用CKK-8试剂检测,细胞抑制率分别为:32.63%、51.14%、58.67%。结论:1.uPA、MMP-9和V-ATPase mRNA和蛋白在肝癌组织中呈高表达,这种高表达与肝癌的浸润转移有关。2.随着肝癌细胞转移潜能的增高,V-ATPase表达增强,在细胞膜分布增加;3.用Bafilomycin A 1抑制V-ATPase,肝癌细胞的迁移能力降低,加大Bafilomycin A 1剂量,细胞受到抑制并出现凋亡。4.抑制V-ATPase会导致癌细胞向细胞外排出酸性物质的能力降低,细胞因酸中毒而死亡,可以考虑作为临床治疗肝癌的一个靶点。