目的：到目前已经建立数百个小鼠胚胎干细胞系，昆明小鼠是我国应用最多的实验小鼠，其建系成功报道极少。小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层是胚胎干细胞培养最常用的方法，但其制备过程繁琐，工作量大，准备周期长，探索一简单小鼠胚胎成纤维细胞饲养层制备方法，建立一有效的昆明小鼠胚胎干细胞分离培养体系，以提高昆明鼠胚胎干细胞建系成功率。　　 方法：昆明小鼠经孕马血清促性腺激素（PMSG）和人绒毛膜促性腺激素（HCG）促排卵，取11.5-16.5d 胎龄的胎鼠用两种简化方法分离培养原代成纤维细胞，倒置显微镜下观察不同培养方法培养的原代和继代鼠胚成纤维细胞（MEF）的生长形态、结构及细胞数量的变化；收集MEF进行冻存保存；MEF 经不同浓度作用时间的丝裂霉素C 处理制备饲养层。昆明鼠交配后3.5-4.5天取胚胎，将胚胎种在添加血清替代物（Knockout serum replacement，KSR）或添加胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）培养液的上述饲养层中培养，观察胚胎贴壁、内细胞团（Inner cell mass，ICM）集落形成率，4-6天后对增殖的内细胞团团块，在0.05%trypsin-0.02EDTA 消化液中用切割法处理后，再接种到新的饲养层上。对传数代后的细胞集落进行干细胞标记物的鉴定。　　 结果：两种简化方法均能培养出高效优质足量的原代MEF；以两种浓度和作用时间的丝裂霉素C 处理，操作方便并获得细胞生长状态良好的饲养层。妊娠3.5天孕鼠适宜胚胎干细胞的分离培养，妊娠3.5天较4-4.5天昆明鼠冲出胚多，囊胚比桑葚胚贴壁率、孵化率高；在0.05%trypsin-0.02%EDTA中切割法进行内细胞团集落的分离，集落增殖快分化低；在含胎牛血清培养液中进行干细胞培养较血清替代物培养液中传代次数多，此培养液更适宜进行分离培养昆明鼠胚胎干细胞。　　 结论：在简化方法制备的胚胎成纤维细胞饲养层上，提供了一有效的分离昆明鼠胚胎干细胞的方法及培养液的选择。