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目的:通过体内、体外研究,探究LncRNA RP11-413M3.4、Notch1在特发性肺纤维化发病机制中的作用。方法:1、体外研究设计为TGF-β1干预成纤维细胞诱导形成肌成纤维细胞模型。细胞分为两组:N组为正常对照组、TGF-β组为模型组。造模前所有细胞饥饿12h使其同步化,TGF-β组细胞加入5ng/ml TGF-β1干预24h后收集细胞,N组加入等体积的PBS溶液24h后收集细胞。Masson染色检测两组细胞中胶原纤维的含量,Western Blot检测两组细胞中Notch1蛋白的表达,RT-PCR检测两组细胞中LncRNA RP11-413M3.4、Notch1mRNA的表达。2、体内研究设计为C57BL/6小鼠气管内注入博来霉素(BLM)诱导形成IPF模型。24只小鼠按照随机数字表随机分成正常对照组(N组)、IPF模型组(I组)和DAPT干预组(I+D组),每组8只小鼠。I组、I+D组小鼠在气管内注入5mg/kg的BLM,N组小鼠在气管内注入等体积的生理盐水。I+D组在造模7d后每日给小鼠腹腔注射5mg/kg的DAPT,共计10d。造模28d后采用颈椎脱臼法处死小鼠,取左肺冻存于-80℃冰箱中用于RT-PCR、Western Blot,右肺甲醛固定后石蜡包埋用于HE、Masson染色、免疫组化、原位杂交。HE、Masson染色用于显示三组小鼠的肺组织病理改变,并根据其组织病理改变采用Ashcroft标准进行评分。Western Blot、免疫组化用于检测三组小鼠肺中Notch1蛋白的表达。原位杂交检测三组小鼠中LncRNA RP11-413M3.4的表达。RT-PCR检测三组小鼠中LncRNA RP11-413M3.4、Notch1mRNA表达。结果:1、体外研究:(1)TGF-β组干预后成纤维细胞大量增殖,数量明显增多,且形态发生了改变,变成细扁平状,分化为肌成纤维细胞。TGF-β1干预后产生的胶原纤维明显高于N组,差异有统计学意义(P<0.05)。说明成纤维细胞用5ng/ml TGF-β1成功诱导出了肌成纤维细胞模型。(2)Western Blot结果表明与N组相比,TGF-β组的Notch1表达量增加,差异有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR结果表明LncRNA RP11-413M3.4、Notch1mRNA的表达量增加,差异有统计学意义(P<0.05)。线性相关分析表明细胞中LncRNA RP11-413M3.4、Notch1 mRNA的表达量呈线性相关,相关系数r=0.8902,有统计学意义(P<0.05)。2、体内研究:(1)HE染色显示I组小鼠肺组织中可见大量肺泡结构破坏,部分肺泡塌陷融合,肺泡间隔增厚。Masson染色肺泡腔和间质内肌成纤维细胞增生聚集,出现了大量宽带状及片状胶原纤维,呈弥漫纤维化改变。I+D组小鼠肺泡结构破坏、纤维化改变较I组轻。I组与N组的比较,Ashcroft评分明显增加,有明显纤维化改变,提示I组小鼠使用BLM诱导IPF造模是可行的。I+D组与I组的比较,Ashcroft评分明显降低,表明使用DAPT可以降低肺纤维化的病变程度。(2)Western Blot结果显示与N组相比,I组的Notch1蛋白表达量增加,组间差异有统计学意义(P<0.05)。与I组相比,I+D组的Notch1蛋白表达量降低,组间差异有统计学意义(P<0.05)。(3)RT-PCR结果显示与N组比较,I组的LncRNA RP11-413M3.4、Notch1mRNA表达量增加,组间差异有统计学意义(P<0.05)。与I组比较,I+D组的LncRNA RP11-413M3.4、Notch1mRNA表达量降低,组间差异有统计学意义(P<0.05)。相关分析结果显示LncRNA RP11-413M3.4、Notch1 mRNA两者成线性相关,相关系数r=0.6259,有统计学意义(P<0.05)。(4)免疫组化结果提示Notch1主要表达于支气管上皮细胞、肺泡细胞的包浆中,原位杂交结果提示LncRNA RP11-413M3.4同样表达于细胞包浆中。与N组比较,I组的LncRNA RP11-413M3.4、Notch1蛋白的表达量增加,组间差异有统计学意义(P<0.05);与I组比较,I+D组的LncRNA RP11-413M3.4、Notch1蛋白的表达量下降,组间差异有统计学意义(P<0.05)。相关分析结果显示LncRNA RP11-413M3.4与Notch1蛋白的表达成线性相关,相关系数r=0.7647,有统计学意义(P<0.05)。结论:1、在细胞因子TGF-β1作用下,成纤维细胞中LncRNA RP11-413M3.4表达上调,可能促进了邻近基因Notch1表达上调,从而促进其增殖分化为肌成纤维细胞和产生大量的胶原纤维。2、在博来霉素诱导的IPF小鼠模型中,细胞质中上调的LncRNA RP11-413M3.4可能正向调控了邻近基因Notch1的表达从而促进了肺纤维化的发生,而DAPT能抑制两者表达而减轻肺纤维化。