研究背景和意义整合素是细胞表面黏附分子家族成员,介导细胞间及细胞与细胞外基质(ECM)的黏附反应,影响细胞基因的表达及细胞内信号传递,调节细胞的各种生物学行为。其中αvβ6是一种特殊类型的整合素亚型,在正常上皮组织、上皮良性肿瘤组织中不表达,在多种恶性上皮源性肿瘤组织中诱导表达,在肿瘤增殖、侵袭和转移中发挥了重要调控作用。目前在口腔、皮肤鳞癌、乳腺癌、结直肠癌、胃癌、胰腺癌、卵巢及富颈癌中均发现αvβ6高表达,在结肠癌领域对αvβ6的研究更为深入细致。前期研究表明：通过转基因诱导表达αvβ6整合素,可使结肠癌细胞分泌MMP-9增多,加速破坏细胞外基质,促进结肠癌肝脏转移。β6链胞内功能段与细胞外信号调节激酶(ERK)之间具有生理性直接连接。αvβ6在结肠癌标本侵袭边缘高表达,在肿瘤内部低表达,作为影响结肠癌预后的重要危险因子,与结肠癌进展密切相关。但是整合素αvβ6对胰腺癌恶性生物学行为、化疗耐药及预后的影响,目前国内外尚未见报道。胰腺癌是预后最差的消化系统恶性肿瘤之一,由于它的高侵袭性和高转移率,使80%以上的病人就诊时已失去了根治性切除的机会,而且胰腺癌对现有的化疗、放疗及免疫治疗均不敏感。在过去20年中胰腺癌5年生存率无显著变化,仍在5%以下。探讨整合素αvβ6对胰腺癌增殖、侵袭、转移、凋亡、化疗耐药及预后的影响,有助于深入理解胰腺癌恶性进展的分子生物学机制,以αvβ6为靶点进行高效无毒的靶向治疗,对于提高胰腺癌的疗效及改善预后将起到重要的促进作用。第一部分整合素αvβ6在胰腺癌组织中的表达及对预后的影响目的研究整合素αvβ6及其相关因子TGF-β1在胰腺导管腺癌组织中的表达情况,与临床病理特征间的关系及对患者预后的影响。方法选择92例胰腺导管腺癌病人的手术病理标本,10例尸解正常胰腺组织作为对照,制作组织芯片；免疫组化染色检测αvβ6、TGF-β1在胰腺癌组织中的表达情况；回顾性分析病人的临床病理资料并随访生存情况,探讨整合素αvβ6、TGF-β1在胰腺癌中的表达情况及其相关性,与临床病理特征之间的关系；通过生存分析,判断其表达高低对患者预后的影响。结果整合素αvβ6在正常胰腺组织中不表达,在胰腺导管腺癌组织中的阳性表达率为56.5%,其表达高低与肿瘤大小(P=0.041),TNM分期(P=0.027)及淋巴结转移(P=0.030)成正相关。TGF-β1在胰腺癌组织中的阳性表达率为66.3%,其表达高低与肿瘤分化不良及TNM分期密切相关。Spearman相关检验证实αvβ6与TGF-β1在胰腺癌中的表达呈正相关关系。Kaplan-Meier生存曲线显示αvβ6高表达的病人中位生存时间较αvβ6低表达的病人明显缩短(P=0.001),单变量及多变量生存分析显示整合素αvβ6是影响胰腺癌预后的独立不良指标。结论整合素αvβ6在胰腺导管腺癌组织中呈现高表达并与TGF-β1的表达情况成正相关,是影响病人预后的一种重要危险因素。意义揭示了整合素αvβ6和TGF-β1在胰腺癌组织中的表达情况及其相关性,与各临床病理特征之间的关系；首次证实整合素αvβ6是影响胰腺癌预后的一个独立不良指标,为更好地判断患者预后并以αvβ6作为靶点对胰腺癌进行靶向治疗提供了实验及理论依据。第二部分整合素αvβ6对胰腺癌细胞增殖、侵袭及转移的影响目的研究整合素αvβ6在胰腺癌细胞中的表达情况及对细胞增殖、侵袭及转移能力的影响。方法选取三种胰腺腺癌细胞系,RT-PCR、流式细胞术检测整合素αvβ6在这三种细胞中的表达高低；选取αvβ6高表达的胰腺癌细胞,应用针对αvβ6的功能性阻断单抗10D5封闭细胞中αvβ6的功能后,MTT法检测细胞增殖能力的变化；Transwell侵袭小室法检测细胞侵袭能力的变化；明胶酶谱及蛋白印迹法检测细胞MMP-9分泌水平的变化；通过比较实验组和对照组之间各组数据的差异,分析整合素αvβ6所起的重要作用。结果RT-PCR及流式细胞检测从转录及蛋白水平证实整合素αvβ6在胰腺癌细胞系PANC-1中高表达,在Capan-2中较高表达,在CFPAC-1中低表达；选取PANC-1及Capan-2细胞应用10D5封闭细胞中αvβ6的功能后,细胞增殖率仅为对照组细胞的(61.94±3.62)%和(67.35±5.02)%；侵袭细胞数目由71±9／HP,36±6／HP分别减少到19±5／HP,13±4／HP；如先用抗MMP-9的单抗Ab-1预处理细胞,则各组的侵袭细胞数减少到相似的水平(20±4／HP,12±5／HP),提示胰腺癌细胞通过重建基底膜的侵袭能力是由整合素αvβ6介导的,并依赖于MMP-9的活性；明胶酶谱及蛋白印迹结果显示阻断细胞中αvβ6的功能后,PANC-1及Capan-2细胞的MMP-9分泌量分别减少到对照组细胞的(9.28±3.11)%和(6.35±2.46)%。结论整合素αvβ6对胰腺癌细胞的体外增殖、侵袭及MMP-9分泌水平起着重要的促进作用。阻断了细胞中αvβ6的功能,就可以显著抑制细胞的增殖、侵袭能力及转移潜能。意义首次检测了整合素αvβ6在不同胰腺癌细胞系的表达情况,揭示了αvβ6在胰腺癌细胞增殖、侵袭及转移过程中的重要作用,为针对αvβ6通过单克隆抗体对胰腺癌进行靶向治疗提供了确切的实验依据。第三部分整合素αvβ6对胰腺癌细胞凋亡及化疗敏感性的影响目的研究整合素αvβ6在胰腺癌细胞凋亡及化疗敏感性中所起的重要作用方法构建针对αvβ6的小片段干扰RNA (small interfering RNA, siRNA),选取干扰效率最强的αvβ6 siRNA,采用脂质体2000将其转染入胰腺癌细胞PANC-1,无效干扰片段RNA转染组作为对照；RT-PCR、Western Blotting检测细胞中αvβ6表达的沉默效果;MMT法检测细胞增殖状态；流式细胞术检测细胞周期分布及细胞凋亡Annexin V-FITC试剂盒测定细胞凋亡率的变化；以吉西他滨为化疗药物,检测抑制αvβ6表达后胰腺癌细胞化疗敏感性及凋亡改变；应用Caspase-3检测试剂盒测定细胞内Caspase-3活性的变化；通过建立BALB／c裸鼠胰腺癌皮下种植瘤模型,比较各组细胞的成瘤能力及αvβ6对肿瘤生长的影响。结果αvβ6 siRNA转染入PANC-1细胞后48小时,细胞内αvβ6的表达在mRNA和蛋白水平均被显著抑制,并持续到转染后96小时。沉默αvβ6表达后PANC-1细胞呈现时间依赖性的增殖抑制；转染后96小时,有41%的PANC-1细胞阻滞在G2／M期,细胞凋亡率升高到13.5±2.3%；吉西他滨可以诱导PANC-1细胞凋亡,应用siRNA沉默αvβ6表达可以提高细胞对吉西他滨的化疗敏感性,增强吉西他滨诱导的Caspase-3介导的细胞凋亡。成瘤实验见αvβ6 siRNA转染组细胞形成肉眼可见的肿瘤时间平均为(15±4.6)d,较对照组(9±2.7)d明显延长。种植后6周,αVβ6 siRNA转染组形成肿瘤的平均体积较阴性转染组明显缩小(170±32mm3vs 760±48mm3,P<0.01)。结论整合素αvβ6在抑制胰腺癌细胞凋亡及增强吉西他滨化疗耐药性中起着重要作用,通过RNA干扰沉默αvβ6表达可以显著抑制胰腺癌细胞体内外增殖,引起细胞周期G2／M阻滞,诱导细胞凋亡及增强吉西他滨化疗敏感性。整合素αVβ6作为胰腺癌靶向治疗新的潜在靶点,有着广阔的临床应用前景。意义首次构建了靶向αvβ6基因的小干扰RNA并将其成功转染入PANC-1胰腺癌细胞,结果显著抑制了胰腺癌细胞的体内外生长,引起细胞周期G2／M阻滞,诱导细胞凋亡并增强了吉西他滨化疗敏感性,为以αvβ6为靶点对胰腺癌进行基因治疗提供了一条新的途径。