研究背景及目的肠易激综合征(irritable bowel syndrome,IBS)是发病率最高的胃肠功能紊乱性疾病之一,实质上并非一种疾病,而是由一系列症状定义的症候群,主要包括反复发作的与排便相关的腹部疼痛,同时伴有排便习惯改变,缺乏能够明确诊断的分子生物学标志物以及形态学诊断标准。该疾病患病率高且呈逐年上升趋势,且患者以青年和中年人为主。由于患者长期反复检查治疗,用于该疾病的医疗费用巨大,家庭负担重,社会危害大。根据患者肠道排便习惯的改变,该疾病又可以分为四种亚型,腹泻型肠易激综合征(diarrhoea-predominant irritable bowel syndrome,IBS-D)、便秘型肠易激综合征(constipation-predominant IBS,IBS-C)、混合型肠易激综合征(mixed IBS,IBS-M)以及未定型肠易激综合征(unsubtyped IBS,IBS-U)。其中IBS-D由于其高患病率、高就诊率和高危害性而受到临床医生和科研者的格外重视。随着对IBS-D研究的不断深入和发展,目前的证据提示多种因素共同参与促进IBS-D的发生,遗传基因或早年生活环境及应激通过脑-肠轴与内脏感觉过敏、肠道运动分泌障碍、肠道菌群紊乱、肠道低度炎症相互作用,共同导致IBS-D的发病,但其具体、精确的机制仍不清楚。临床上缺乏解释IBS-D相关症状的形态学和生化指标异常,对该疾病生物标志物或关键作用靶点研究较少;对于该疾病的治疗主要依据患者腹部症状的严重程度以及心理合并症的程度,从简单的宣教、生活方式的调整到药物治疗,但其治疗效果尚存在争议。因此,研究IBS的发病机制,明确该疾病生物标志物或关键作用靶点将有助于指导临床诊断及治疗,同时可以减轻患者痛苦,降低社会医疗负担。因此本研拟通过动物实验,明确toll样受体4/核因子κB(Toll-like receptor 4/nuclear factor-κB,TLR4/NF-κB)信号通路在IBS-D发病中的作用及可能机制,为研究IBS-D的发生机制和寻找有效防治措施提供理论依据。方法选择30只SPF级Wistar大鼠(雌性,质量:160±10g)为实验动物。采用随机数字法将上述30只大鼠随机分为3组,分别为IBS-D组、PDTC(二硫代氨基甲酸吡咯烷,pyrrolidine dithiocarbamate)组及对照组,每组10只。IBS-D组为动物模型组,接受28天急-慢应激法构建IBS-D大鼠模型;PDTC组为药物干预组,接受急慢应激法+PDTC处理(腹腔注射PDTC,50mg/kg/wk,连续4周);对照组大鼠正常饲养。于造模0、7、14、21、28天记录三组大鼠体重、AWR压力阈值、蔗糖水摄入量,造模28-31天记录三组稀便率、排便量,并收集三组大鼠粪便标本,实时定量PCR法检测肠道菌群(双歧杆菌、乳酸杆菌及大肠杆菌);实验第31天采集静脉血液,酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测大鼠血清炎性因子(TNF-α、IL-8、IL-10、MYD88),取结肠标本,免疫印迹法(western-blot)检测肠道组织TLR4、NF-κB、claudin-1。将大鼠肠道组织标本行苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,HE),使用光学显微镜观察肠道组织黏膜的微观结构。结果1、造模第4周,三组大鼠1h排便量比较:IBS-D最多(7.14±0.84),PDTC组次之(5.24±0.55),对照组最少(0.82±0.42),三组间差异显著(F=239.295,P=0.000);两两比较,IBS-D组明显(P<0.05)高于PDTC和对照组。比较三组大鼠湿粪率:IBS-D最高(12.15±0.85),PDTC组次之(7.25±0.58),对照组最低(0),三组间差异具有统计学意义(F=1072.929,P=0.000);两两比较,IBS-D组湿便率明显高于PDTC和对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。2、IBS-D组、PDTC组以及对照组大鼠基线时腹部撤回反射(abdominal withdral reflex,AWR)疼痛阈值比较,差异无统计学意义;随着时间的增加,对照组大鼠AWR疼痛阈值逐渐增加,IBS-D组AWR疼痛阈值成波动变化,整体趋势为降低,PDTC组AWR疼痛阈值成波动变化,整体变化不明显;从第1周到第3周,三组之间出现统计学差异(1周:F=6.601,P=0.005,2周:F=17.476,P=0.000,三周:F=14.577,P=0.000),但两两比较,只有IBS-D组与对照组存在统计学差异(P=0.001,0.000,0.000),IBS-D组与PDTC组并无统计学差异(P=0.180,0.232,0.349);第4周,PDTC组及对照组大鼠AWR疼痛阈值较前增加,但IBS-D组大鼠AWR疼痛阈值降低,三组大鼠AWR疼痛阈值出现明显统计学差异(F=66.879,P=0.000),两两比较,结果显示IBS-D组(27.17±1.50)AWR疼痛阈值明显低于PDTC组(30.33±2.56)及对照组(38.67±2.33),差异有统计学意义(P<0.001)。3、IBS-D组、PDTC组以及对照组大鼠基线时AWR最大耐受阈值比较,差异无统计学意义;随着应激因素的作用,对照组大鼠AWR最大耐受阈值逐渐增加,IBS-D组与PDTC组AWR最大耐受阈值成波动变化,整体趋势下降,从第1周到第3周,三组之间出现统计学差异(1周:F=4.158,P=0.027,2周:F=8.496,P=0.001,3周:F=16.390,P=0.000),两两比较,IBS-D组与对照组存在统计学差异(P=0.001,0.000,0.000),第2周IBS-D组与PDTC组存在统计学差异(P=0.014);第4周,对照组大鼠AWR最大耐受阈值较前增加,但PDTC组及IBS-D组大鼠AWR最大耐受阈值降低,三组大鼠AWR最大耐受阈值出现明显统计学差异(F=54.281,P=0.000),两两比较,结果显示IBS-D组(37.67±2.80)AWR最大耐受阈值明显低于及对照组(51.00±2.90),差异有统计学意义(P<0.001),但与PDTC组(40.00±2.89)相比差异无统计学意义(P>0.05)。4、IBS-D组、PDTC组以及对照组大鼠基线时蔗糖水摄入量比较,差异无统计学意义;从第1周到第3周,三组大鼠蔗糖水摄取量逐渐增加,但随着应激因素的作用,三组之间出现统计学差异(1周:F=6.204,P=0.006,2周:F=6.521,P=0.005,3周:F=5.845,P=0.008);第4周,PDTC组及对照组大鼠蔗糖水摄取量继续增加,但IBS-D组大鼠蔗糖水摄取量降低,三组大鼠蔗糖水摄取量出现明显统计学差异(F=27.362,P=0.000),两两比较,结果显示IBS-D组(14.1±1.81)蔗糖水摄取量明显低于PDTC组(16.4±1.58)及对照组(19.4±1.26),差异有统计学意义(P<0.001)。5、IBS-D组、PDTC组及对照组大鼠基线体重比较无统计学差异;随着研究的进程,三组大鼠体重均持续升高,但是对照组大鼠增加趋势更加明显,PDTC组次之,IBS-D组增加趋势最小。实验第4周,IBS-D组(279.37±9.47)、PDTC组(294.14±6.39)及对照组(313.91±6.66)大鼠体重比较,差异存在统计学意义(F=49.915,P=0.000),两两比较,IBS-D组明显低于对照组(P=0.000),同时IBS-D组与PDTC组比较,差异也存在统计学意义(P=0.000)。6、三组大鼠结肠组织活体标本大体观察,外观结构及内部黏膜均未见明显水肿、糜烂、溃疡、出血。HE染色后光镜放大100倍观察各组大鼠结肠黏膜,未见明显糜烂、水肿、溃疡、出血,固有层内无或有少量中性粒细胞浸润,间质无明显水肿。7、用Western blot方法检测大鼠肠道组织TLR4和NF-κB的表达,从染色密度的角度比较,IBS-D组TLR4染色最深,PDTC组次之,对照组大鼠染色最浅。同样,IBS-D组NF-κB(p65)染色最深,PDTC组次之,对照组大鼠染色最浅;比较三组大鼠TLR4的灰度值比值,整体比较差异有统计学意义(F=34.436,P<0.001);两两比较,结果显示IBS-D组(1.52±0.08)TLR4灰度值比值明显高于PDTC组(1.22±0.19)及对照组(1.00±0.11),差异有统计学意义(P<0.001);比较三组大鼠NF-κB(p65)的灰度值比值,整体比较差异有统计学意义(F=28.074,P<0.001);两两比较,结果提示IBS-D组(1.88±0.29)NF-κB(p65)的灰度值比值较PDTC组(1.48±0.18)及对照组(1.00±0.30)明显增高,差异有统计学意义(P<0.05)。8、使用ELISA方法检测大鼠血清IL-8,IL-10的表达,促炎因子IL-8:IBS-D最高(2714.61±1450.23),PDTC组次之(1594.21±610.46),对照组最低(1135.97±311.03),三组间存在统计学差异(F=7.954,P=0.002),两两比较,IBS-D组分别高于PDTC和对照组(P<0.05);炎症抑制因子IL-10:IBS-D最低(214.64±69.05),PDTC组次之(280.96±87.80),对照组最高(368.86±81.01),三组间存在统计学差异(F=9.357,P=0.001),两两比较,IBS-D组低于对照组(P<0.05),但与PDTC组无明显统计学差异(P=0.108)。9、使用ELISA方法检测大鼠血清TNF-α及MYD88的表达,促炎因子TNF-α:IBS-D最高(375.83±73.83),PDTC组次之(289.62±57.58),对照组最低(246.62±30.71),三组间存在统计学差异(F=13.374,P=0.000),两两比较,IBS-D组分别高于PDTC和对照组(P<0.05);MYD88:IBS-D最高(3435.11±581.21),PDTC组次之(2533.28±472.45),对照组最低(2028.20±495.27),三组间存在统计学差异(F=18.900,P=0.000),两两比较,IBS-D组分别高于PDTC和对照组(P<0.05)。10、使用Image-Pro Plus 6.0软件测量放大40倍图像下黏膜厚度,IBS-D组黏膜最薄(177.59±45.10),PDTC组次之(224.21±4.53),对照组最厚(249.01±33.18),三组整体比较差异有统计学意义(F=12.50,P<0.001);两两比较,结果显示IBS-D组黏膜厚度明显低于PDTC组及对照组,差异有统计学意义(P<0.001)。11、使用放大200倍的光学显微镜观察HE染色后的大鼠结肠黏膜结构。在正常对照组大鼠中,肠上皮完整,排列整齐,无上皮结构损失,腺体正常,隐窝结构存在。部分IBS-D组大鼠存在上皮变性、坏死,上皮与固有层分离,部分肠黏膜固有层破坏,隐窝结构消失,但是病变相对局限,不是所有视野下都能发现;PDTC组肠黏膜屏障破坏较IBS-D小,只有少量上皮缺失、坏死,部分上皮与固有层分离,病变范围及程度较IBS-D组轻。12、使用Western blot方法检测大鼠肠道组织claudin-1的表达,从染色密度的角度比较,IBS-D组claudin-1染色最浅,PDTC组次之,对照组大鼠染色最深。13、三组大鼠双歧杆菌比较,对照组最高(4.41±0.50),PDTC组次之(3.91±0.43),IBS-D最低(3.73±0.51),三组间存在统计学差异(F=6.614,P=0.005),两两比较,IBS-D组明显低于对照组(P<0.05),PDTC组高于IBS-D组,但差异无统计学意义(P>0.05);三组大鼠大肠杆菌比较,IBS-D最高(7.64±1.12),PDTC组次之(7.03±1.77),对照组最低(6.13±0.75),三组间存在统计学差异(F=4.110,P=0.028),两两比较,IBS-D组明显高于对照组,差异存在统计学意义(P<0.05),PDTC组低于IBS-D组,但差异不存在统计学意义(P>0.05);三组大鼠乳酸杆菌比较,对照组最高(6.91±0.28),PDTC组次之(6.64±0.32),IBS-D最低(6.21±0.54),三组间存在统计学差异(F=7.760,P=0.002),两两比较,IBS-D组明显低于对照组(P<0.05),PDTC组高于IBS-D组(P<0.05)。上述结果提示:1、从症状学及疾病特点分析,使用急慢应激构建IBS-D大鼠模型成功,能够满足本研究对于IBS-D疾病特点的要求;2、IBS-D大鼠较正常大鼠肠道黏膜高表达NF-κB(p65)蛋白及TLR4蛋白;3、IBS-D大鼠促炎细胞因子IL-8,MYD88及TNF-α高于正常大鼠,抑炎因子IL-10低于正常大鼠;4、IBS-D大鼠肠道益生菌双歧杆菌、乳酸杆菌低于正常大鼠,有害菌大肠杆菌高于正常大鼠;5、IBS-D大鼠肠道黏膜机械屏障受到破坏(黏膜厚度变薄,部分结构不完整,紧密连接蛋白claudin-1表达减少);6、TLR4/NF-κB信号通路阻断剂发挥作用,腹腔注射PDTC后,IBS-D大鼠肠道黏膜NF-κB(p65)及TLR4蛋白表达减少;7、阻断TLR4/NF-κB信号通路后,IBS-D大鼠症状较前好转,促炎因子(IL-8,TNF-α,MYD88)较前降低;有益菌双歧杆菌、乳酸杆菌有所增加,有害菌大肠杆菌数量降低,但部分益生菌(乳酸杆菌)增加趋势更加明显;肠道黏膜机械屏障破坏情况得到改善。结论1、IBS-D大鼠TLR4/NF-κB信号通路高表达,存在炎性因子失衡、菌群失调、肠黏膜机械屏障破坏;2、TLR4/NF-κB信号通路在IBS-D的发病及症状改善中发挥一定作用,其可能的机制为影响炎性因子释放、纠正菌群失调及保护肠道黏膜机械屏障。