蛋白质组学是后基因组学的主要内容之一,近年来得到了迅速发展,在生物分子的分析方面广泛应用。本研究以琯溪蜜柚(Citrus grandis cv.Guanximiyou)汁胞为材料,利用双向电泳、质谱技术,对琯溪蜜柚汁胞不同发育时期进行了差异蛋白质组学的分析。建立了适合琯溪蜜柚汁胞蛋白质组学研究的技术平台。获得与汁胞发育、成熟和衰老相关的差异蛋白质,进行了差异蛋白质组分析和生物信息学的研究,并对其中的部分差异蛋白质进行cDNA克隆及原核表达分析。主要研究结果如下:1.建立了适合琯溪蜜柚汁胞蛋白质分离的、稳定性好、分辨率高的双向电泳技术体系,对汁胞发育不同时期和不同粒化程度的蛋白质组差异进行比较。汁胞共检测到1037±60个蛋白质点,其中有100个蛋白质点在不同发育时期上调表达, 217个蛋白质点下调表达,完全特异的蛋白质点有85~511个;有108个蛋白质点在不同粒化程度中上调表达,107个蛋白质下调表达,约400个完全特异的蛋白质点。2.选取琯溪蜜柚不同发育时期的汁胞50个差异蛋白质点进行MALDI-TOF/TOF质谱分析,48个获得了完整的肽指纹图谱,将肽段数据导入NCBInr Viridiplantae蛋白质数据库,用MASCOT搜索鉴定出24个蛋白质点;通过生物信息学分析,根据蛋白质的功能可以把他们划分为调控蛋白,转录因子,能量代谢,细胞骨架,防卫反应,代谢酶,以及未知功能的蛋白质。另外有10个只能在柑橘EST中得到鉴定。蛋白、核酸和EST序列数据库的综合应用提高了蛋白质鉴定的成功率。还有一些差异表达没有鉴定成功可能与现在的蛋白质数据库不够全面有关。选取琯溪蜜柚正常与粒化汁胞中的30个差异蛋白质点进行MALDI-TOF/TOF质谱分析,其中27个获得了完整的肽指纹图谱,将肽段数据导入NCBInr Viridiplantae和NCBI CitrusEST数据库进行检索,鉴定出19个蛋白质点,其中有8个只能在柑橘EST中得到鉴定,通过生物信息学分析是关于转录活性因子蛋白、GTP结合蛋白、Hsp70、APX、温度诱导脂质运载蛋白和Actin。3.鉴定出的差异蛋白质点G6能够与序列号gi|188431972的Citrus EST序列匹配上,通过RACE技术进行G6的cDNA克隆,得到一个902bp片段的序列。通过Blast和DNAMAN同源性比较分析,推测其是一个Germin-like protein。Germin蛋白的多糖部分为HS-GGAX,是细胞壁半纤维素的直接前体,与植物细胞壁伸展性的增加密切相关,同时,Germin具有草酸氧化酶活性。推测Germin通过控制细胞壁的伸展性在琯溪蜜柚汁胞的粒化中起作用。4.质谱鉴定结果中有3个和APX匹配的差异蛋白质点,表明APX与汁胞发育(粒化)是密切相关的。为此,对APX在汁胞发育过程和不同粒化程度中的活性动态和分子克隆方面作了进一步的研究。(1)选取不同发育时期的琯溪蜜柚汁胞进行它们的APX活性测定及同工酶分析,随着成熟度的增加,APX活性成一个上升趋势,到果实成熟时趋向稳定。取不同粒化程度的汁胞进行它们的APX活性测定及同工酶分析。APX与汁胞发育是密切相关的,同时发现粒化样品的APX活性随着粒化指数的提高而变大。(2)根据已克隆的其他植物的APX基因的保守序列设计引物,采用同源克隆的方法从琯溪蜜柚汁胞中获得了APX1 cDNA片段,根据获得的cDNA片段的序列设计RACE引物,通过RACE法获得了全长为1118 bp的琯溪蜜柚汁胞APX1 cDNA全序列,包含750bp的开放读码框,编码250个通读的氨基酸序列。具有过氧化物酶活性位点信号和亚铁血红素结合基信号。琯溪蜜柚APX1的氨基酸序列与已报道的拟南芥、烟草、番茄、水稻等植物APX有很高的同源性。其核酸序列与龙眼的APX同源性高达87%,与荔枝的同源性86%,与胡杨的同源性85%,与葡萄的同源性84%,与番茄的同源性81%。目前APX1cDNA序列已在GenBank上注册,登录号为gb|FJ595794.1。通过构建重组质粒p32-APX1,转化至Trans Rosetta(DE3)中,当诱导温度为37℃,IPTG浓度为1mM,诱导时间为4h时,其在大肠杆菌宿主中获得了表达。(3)根据鉴定出的蛋白质氨基酸序列反推出碱基序列,设计特异的APX引物,通过RT-PCR克隆的方法从琯溪蜜柚汁胞中获得了APX2cDNA片段,根据获得的cDNA片段的序列设计RACE引物,通过RACE法获得了全长为1061 bp琯溪蜜柚汁胞APX2的cDNA全序列,包含753 bp的开放读码框,编码250个通读的氨基酸序列。对已报道的拟南芥、烟草、番茄、水稻等植物APX与琯溪蜜柚APX 2的氨基酸序列分析,与可可的APX同源性高达82%,与橡胶、茶树、桉树的同源性81%,与甘薯的同源性80%,与葡萄、胡杨的同源性79%,与花生、大豆的同源性78%。同时,进行2个APX cDNA编码的氨基酸产物同源性分析,发现它们的同源性为81.67%,都含有APX基因家族的保守结构域。与差异蛋白质点的肽指纹数据分析,推测APX2是差异蛋白质点Aa。目前APX2 cDNA已在GenBank上注册,登录号为gb|FJ595795。通过构建重组质粒p28-APX2,转化至BL21(DE3)中,当诱导温度为37℃,IPTG浓度为1mM,诱导时间为4h时,其在大肠杆菌宿主中获得了表达。5.根据鉴定出的差异蛋白质ACTIN和HSP的氨基酸序列反推出碱基序列,设计ACTIN和HSP的特异引物,通过RT-PCR克隆的方法从琯溪蜜柚汁胞中获得了ACTIN cDNA的开放读码框和一个1879bp的HSP cDNA片段序列。ACTIN cDNA ORF共有1131个碱基组成,编码377个氨基酸。