扇贝边多肽制备及其生物活性研究

来源 :烟台大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:YANYUGUOHOU
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海湾扇贝是一种具有很高经济价值的双壳类动物,目前在我国东部沿海广泛养殖。在生产扇贝柱(干贝)的过程中会产生大量低值副产物(包括裙边、贝壳、生殖腺),这些副产物容易腐烂,会引起环境污染。海湾扇贝边蛋白质含量较高,是制备活性肽(蛋白酶解物)的良好原料。本论文分析了海湾扇贝边的化学组成,优化了海湾扇贝边蛋白酶解的条件,并对酶解产物的部分生物活性进行了研究。本研究为海湾扇贝边的开发与利用提供了理论和实验依据。  研究结果显示:扇贝边干粉营养丰富,总蛋白质的含量为68.16g/100g,总脂肪含量为3.50g/100g,水分含量为5.50g/100g,多糖含量为1.43g/100g,灰分含量为11.80g/100g。17种氨基酸的总量为69.30g/100g,人体必需氨基酸(色氨酸除外)含量为22.79g/100g。具有较强还原能力的半胱氨酸的含量为5.86g/100g,是扇贝边酶解多肽具有较强抗氧化活性的主要原因之一。共检测了27种脂肪酸的相对含量。其中饱和脂肪酸含量为27.53%,不饱和脂肪酸的含量为56.19%。油酸的相对含量最高为21.66%,其次为棕榈酸和亚油酸。  以水解度为考察指标,对中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和酸性蛋白酶水解扇贝边的能力进行了探究。发现碱性蛋白酶对扇贝边的水解能力最强,因此确定利用碱性蛋白酶来水解扇贝边制备酶解多肽。利用单因素实验和正交实验对碱性蛋白酶水解扇贝边的条件进行了优化,结果显示:影响碱性蛋白酶活性的各因素的排列顺序为pH、温度、底物浓度与酶浓度的比值([S]/[E])、时间。最佳水解条件:[S]/[E]为12、时间为4h、温度为60℃、pH为10。在此条件下水解率为30.1%。探究了活性炭对扇贝边酶解液的脱色效果。当活性炭用量为2%、时间为60min、温度为40℃、pH为6时脱色效果最好。  利用快速蛋白液相色谱(FPLC)、高效液相色谱(HPLC)和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术对扇贝边酶解液中多肽的组成及其主要组分的分子量进行了测定。结果表明扇贝边酶解多肽中主要有3种多肽成分,它们的分子量分别为7.87、3.54和0.91kD。  以谷胱甘肽为对照物,探究了扇贝边酶解多肽的抗氧化能力。结果表明,扇贝边酶解多肽对羟自由基、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH自由基)和ABTS+自由基的清除能力与酶解多肽的浓度呈现一定的量效关系。随着酶解多肽浓度的增加,对3种自由基的清除能力逐渐增大。当酶解多肽的浓度分别为0.20mg/mL、0.20mg/mL和0.25mg/mL时,其对羟自由基、DPPH自由基和ABTS+自由基的清除率达到最大值,分别为65.5%、79.3%和62.3%。以羟自由基清除率和DPPH自由基清除率为指标分别测定了分子量大于3kD和小于3 kD的多肽组分的抗氧化能力,发现分子量小于3kD的多肽组分有较强的抗氧化能力。  考察了扇贝边酶解多肽的降血压和降血糖活性。当扇贝边酶解多肽的浓度为0.40mg/mL和0.50mg/mL时,其对ACE酶和α-葡萄糖苷酶的抑制率达到最大值,分别为65.1%和54.8%。IC50值分别为0.32mg/mL和0.38mg/mL。以对ACE酶和α-葡萄糖苷酶的抑制率为指标测定了分子量大于3kD和小于3kD的多肽组分的降血压和降血糖活性,发现分子量小于3kD的多肽组分具有较强的降血压和降血糖活性。  本论文利用百草枯对模型组和治疗组小鼠进行灌胃造模,利用扇贝边酶解多肽对治疗组的小鼠进行灌胃治疗。分别于造模后14天和28天进行肺组织取材,对肺组织进行HE染色并测定肺组织中超氧化物歧化酶(SOD)的活性和羟脯氨酸(HYP)的含量。肺组织切片HE染色结果显示,扇贝边酶解多肽对百草枯诱导的小鼠肺纤维化有一定的治疗作用。扇贝边酶解多肽并没有提高小鼠肺组织中SOD的活性。治疗组小鼠肺组织中HYP的含量要低于模型组肺组织中羟脯氨酸的含量。说明扇贝边酶解多肽能够减缓肺纤维化病情进一步发展的进程。
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